Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

Dendritische spines zijn membraanuitstulpingen van de dendriet van een neuron die synaptische input ontvangen. Het verlengen, krimpen, verschijnen of verdwijnen van spines vindt plaats als reactie op veranderingen in de functie van het neurale netwerk die voortvloeien uit specifieke patronen van neurale activiteit. Dit fenomeen staat bekend als corticale plasticiteit om morfologische veranderingen in dendritische spines te observeren.

Bij levende dieren wordt een beeldplaat op de schedel van een muis bevestigd. Een deel van de schedel wordt chirurgisch uitgedund en er zijn beelden vereist bij lage en hoge vergroting. De gebieden worden vervolgens op latere tijdstippen opnieuw in beeld gebracht.

De verkregen resultaten laten zien dat de morfologie van dendritische stekels duidelijk gevisualiseerd kan worden met een dunne schedelpreparaat op meerdere tijdstippen. Daarnaast is gebleken dat de morfologie van de stekels zeer plastisch is, waarbij veranderingen in structuur en zowel het verschijnen als het verdwijnen van dendritische stekels waarneembaar zijn. Hallo, ik ben Emily Kelly uit het laboratorium van Anaya Maka van de afdeling Neurobiology and Anatomy aan de University of Rochester.

Vandaag laten we u de procedure zien voor chronische beeldvorming van de visuele cortex van de muis na een zogenaamde 'fins'-preparatie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de omzetting van dendritische stekels te bestuderen. Laten we beginnen.

Begin de procedure door de instrumenten voor aseptische chirurgie te steriliseren. Steriliseer vervolgens de werkruimte met 70% ethanol en bedek het operatievlak met een schoon verband. Controleer de diepte van de anesthesie bij een muis die is geanestheseerd met een fentanylcocktail door de reactie op een kneepje in de teen te testen; de hier getoonde muis is een A-G-F-P-M transgene muis waarin GFP tot expressie komt.

In laag vijf projecteren parametale cellen dendritische uitlopers naar de oppervlakkige lagen. Om een lichaamstemperatuur van 37.5 °C te handhaven, wordt het dier op een warmtemat geplaatst en gemonitord met een aangekoppelde rectale thermometer. Breng vervolgens met een schaar oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.

Verwijder het haar van de achterkant van de kop van de muis, van achter de oren tot aan de ogen. Reinig vervolgens de bovenkant van de kop van het dier door 70% ethanol aan te brengen, gevolgd door Betadine scrub en Betadine oplossing. Maak een LCU-incisie achter de oren en omhoog langs respectievelijk de rechter- of linkerkant van de middellijn, afhankelijk van welk hersenhalve naar de ogen wordt afgebeeld; vouw de huid vervolgens over en weg van de operatielocatie.

Verwijder de huid niet, aangezien deze later met een fijne pincet wordt gehecht. Trek de huid voorzichtig omhoog en weg van het betreffende gebied. Schraap met een schone pincet voorzichtig het periosteum van het blootgestelde gedeelte van de schedel.

Breng een kleine hoeveelheid 10% fair chloride aan op de schedel om het periosteummembraan volledig uit te drogen en te bevestigen dat het volledig is verwijderd. Het is belangrijk dat de schedel volledig droog is. Om een goede hechting van de lijm te garanderen, schraapt u het uitgedroogde periosteummembraan voorzichtig weg met een microschirurgisch mesje.

Breng vervolgens een dunne laag Sano acrylijm aan rond het beeldvenster van de roestvrijstalen kopplaat en bevestig de plaat aan de schedel. Breng met het houten uiteinde van een wattenstaafje lijm aan op de binnenste naden van het beeldvenster, waarbij u er op let dat alle openingen tussen de beeldplaat en de kromming van de schedel worden opgevuld. Plaats een druppel van de lijmversneller in het venster.

Veeg vervolgens snel het teveel weg. Laat de lijm drogen. Gebruik een tandartsboor voorzien van een 0,7 millimeter roestvrijstalen boortje om de schedel in het beeldvenster dunner te maken.

Wissel het boren af met incidentele toepassing van 0,9% steriele zoutoplossing om overmatige warmteontwikkeling op de schedel te voorkomen. Maak een venster van vier bij vier millimeter in de schedel door kleine bewegingen over het schedeloppervlak te maken.

Gebruik de tandartsboor. Test de dikte van de schedel met stompe pincetten. Het schedeloppervlak zal bij lichte druk enigszins indeuken.

De optimale schedeldikte voor beeldvorming ligt tussen 10 en 30 micron. Zodra de schedel is uitgedund, dient het venster te worden gereinigd van alle resten en moet er zoutoplossing op de schedel worden aangebracht. Fotografeer het beeldvormingsvenster met een digitale camera die is gemonteerd op een dissectiescoop.

De hersenvasculatuur op deze foto helpt bij het bepalen van de positie voor het plaatsen van de beeldplaat voor volgende beeldsessies. Transporteer het dier naar de twee-fotonenopstelling. Het dier moet op de warmtedeken blijven en de lichaamstemperatuur dient gedurende de gehele beeldsessie continu te worden gemonitord.

Een tweefotonmicroscoop met een Mi.Tai-laser. Er wordt gebruikgemaakt van een solid-state pomplaser van 10 watt voor maximaal vermogen en een aangepaste Olympus flow view confocale unit. Het systeem is geoptimaliseerd voor diepe weefselbeeldvorming en externe detectoren zijn zo dicht mogelijk bij het objectief geïnstalleerd om maximale detectie van fluorescentie uit de hersenen mogelijk te maken; voeg een druppel zoutoplossing toe aan het beeldvenster met een lage digitale zoom.

Identificeer een gebied met helder gelabelde neuronen met behulp van een digitale camera die op de microscoop is bevestigd. Maak vervolgens een foto van het beeldgebied. Dit is noodzakelijk om op een later tijdstip terug te keren naar dezelfde beeldlocatie.

Verkrijg een stack met lage vergroting door de gehele zichtbare omvang van de hersenen om de mate van dendritische vertakking te tonen. Dit zal worden gebruikt om het beeldgevingsgebied op volgende tijdstippen te lokaliseren, aangezien zowel bloedvaten als dendrieten hun structuur behouden in jonge en volwassen dieren met behulp van beeldgevingssoftware.

Verhoog de digitale vergroting met een factor acht, pas indien nodig de XY-coördinaten aan en verzamel een stack met hoge vergroting, die de gedetailleerde dendritische morfologie zal tonen, inclusief de locaties en structuur van dendritische spines. Maak gedetailleerde aantekeningen over elke stack-verzameling, inclusief de pan-coördinaten, het verzamelbereik, de Z-stapgrootte en het aantal stappen in de stack. Deze aantekeningen worden gebruikt bij het terugkeren naar deze dendriet of axon op een later tijdstip.

Verwijder na de beeldvorming de hoofdplaat door deze voorzichtig van het schedeloppervlak te scheiden met een pincet. Verwijder alle lijmresten en veeg de schedel schoon met 0,9% steriele zoutoplossing.

Hecht de huid over de schedel samen met hechtgaren nummer zes. Veeg het gebied na de beeldvormingsprocedure af met 70% ethanol. Plaats het dier in een schone kooi onder een warmtelamp totdat het wakker wordt en mobiel is.

Plaats het dier vervolgens terug in de oorspronkelijke kooi om het dier op een later tijdstip opnieuw te beelden, variërend van twee dagen tot vele maanden later; verwijder de hechtingen en open de huid op de kop opnieuw. Gebruik met aseptische methoden de digitale afbeelding van de hersenvasculatuur die tijdens de eerste operatie is gemaakt om de oorspronkelijke beeldlocatie te bepalen. Fixeer vervolgens de kopplaat opnieuw zoals voorheen.

Gebruik indien nodig een microsurgisch mesje om voorzichtig eventueel bot weg te schrapen dat tussen de beeldvormingsmomenten is teruggegroeid. Dun het bot verder uit met een tandheelkundige boor, maak het beeldvormingsvenster vrij van debris en breng een druppel 0,9% steriele zoutoplossing aan. Breng het dier naar een tweefotonenmicroscoop en lokaliseer het oorspronkelijke beeldvormingsgebied aan de hand van de digitale fluorescentieafbeelding die tijdens de vorige sessie is gemaakt.

Start het programma voor de flowview. Open de oorspronkelijke afbeelding met lage vergroting, bevestig een transparante vel op het computerscherm en schets het patroon van de belangrijkste bloedvaten met een transparantpen. Open vervolgens het live-beeld en lijn de bloedvaten opnieuw uit met het geschetste patroon op de transparante folie.

Verwijder de transparantie om de acht keer ingezoomde structuren opnieuw te beelden. Open de gewenste verzamelde stack uit de vorige beeldsessie. Schets de structuur op een transparantiefolie die op het computerscherm is bevestigd.

Zoom acht x in op het live-beeld en lijn het beeld uit met de transparantie. Afhankelijk van de nauwkeurigheid van de uitlijning bij de lage vergroting, kan het nodig zijn om ook de hoek van het beeld enigszins aan te passen; stel de pan-coördinaten in op de beeldparameters van de eerste dag, inclusief de stapgrootte en het aantal te verzamelen beelden voor de z-stack. De herimaging kan tweemaal worden uitgevoerd. Het aantal keren dat de hoofdhuid wordt geopend, moet worden beperkt om te voorkomen dat de integriteit van de schedel wordt aangetast, wat zou leiden tot een slechte beeldresolutie bij GFP-expresserende muizen.

Een subset van parametale cellen in laag vijf en de bijbehorende dendritische uitlopers werden hier gevisualiseerd met in vivo tweefoton laser-scanning microscopie; GFP-gelabelde dendrieten van de visuele cortex worden getoond. Deze afbeelding is een projectie van een enkele afbeelding die elke vijf micron werd genomen vanaf de PIA tot een uiteindelijke diepte van 175 micron. Het omkaderde gebied wordt hier op een hogere vergroting getoond op dag nul, en opnieuw op dag vier hier; een vergelijking van afbeeldingen met een hogere vergroting van een dendritische vertakking van dag nul en dag vier.

Deze afbeeldingen tonen stabiele spines, aangegeven door de witte pijlpunten, verdwenen of terugtrekkende spines, gemarkeerd door de rode pijlpunten, en nieuwe spines, aangegeven door de groene pijlpunten. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u chronische tweefoton-imaging uitvoert in de visuele cortex van de muis met behulp van een dunne schedelpreparaat. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er tijdens het dunnen extra zorgvuldig te werk moet worden gegaan om schade aan de schedel en de onderliggende dura te voorkomen, aangezien dit zal leiden tot een slechte beeldresolutie, en dat gedetailleerde aantekeningen moeten worden gemaakt.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.