Een craniotomie chirurgische ingreep voor chronische Brain Imaging

Beeldvormingstechnieken worden steeds belangrijker bij het bestuderen van de hersenfunctie. Hiervan is tweefotonen-laser-microscopie naar voren gekomen als een uiterst nuttige methode, omdat het de studie van de levende hersenen mogelijk maakt met geschikte preparaties. Deze techniek maakt het mogelijk om chronisch hetzelfde corticale gebied te observeren, gedurende perioden variërend van minuten tot maanden.

In deze video tonen we een preparatie voor chronische in vivo beeldvorming van de hersenen met behulp van tweefotonmicroscopie. Dr. Carl Voda, een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute op Janelia Farm, was oorspronkelijk de pionier van de craniële vensterpreparatie die we vandaag zullen demonstreren. Hi en Ricardo must uit het laboratorium van Carlos Porter Cayo van de afdeling Neurologie aan de University of California Los Angeles.

Vandaag laten we u de procedure zien voor het maken van een craniële window voor chronische in vivo imaging. Deze preparatie is zeer nuttig omdat het mogelijk maakt om diep in de hersenen te beelden met een tweefoton-lasermicroscoop. Laten we beginnen.

Voordat de operatie begint, worden de muizen geanestheseerd met isofluraan. 4% voor inductie, 1,5 tot 2% voor de operatie, gebruikmakend van door de I-A-C-U-C goedgekeurde procedures; het is belangrijk om knijpprikkels aan de staart en/of tenen toe te passen om er zeker van te zijn dat het dier volledig gesedeerd is. Met een knaagdiertrimmer wordt het haar vanaf de nek tot aan de ogen afgeschoren.

Na het scheren wordt de muis op een stereotaxisch frame geplaatst, rustend op een watercirculerende warmtedeken die is ingesteld op 37 °C, waarbij de kop stevig wordt vastgezet met oorstaven. Vervolgens wordt oogzalf aangebracht om uitdroging van het oog van het dier te voorkomen. Daarna worden dexamethason (0,2 mg/kg) en carprofen (5 mg/kg) subcutaan toegediend.

Om hersenzwelling en/of een ontstekingsreactie te voorkomen. Steriliseer vóór aanvang van de operatie het operatiegebied door de huid af te vegen met drie afwisselende swabs van 70% alcohol en Betadine. Alle chirurgische instrumenten zijn vooraf gesteriliseerd met een glaskraalsterilisator, inclusief scharen die zijn besproeid met ethanol.

De huid over de bovenkant van de schedel wordt verwijderd, beginnend met een horizontale snede langs de basis van de kop, gevolgd door twee sneden in rostrale richting, die bijna tot aan de oogleden reiken. Vervolgens worden er twee schuine sneden gemaakt die in de middellijn samenkomen. Op dit punt wordt een druppel lidocaïne- en epinefrine-oplossing op het periosteum aangebracht om overmatig bloeden te voorkomen; met een scalpel wordt het periosteum vervolgens naar de randen van de schedel teruggetrokken.

De musculatuur van de nek wordt ook lichtjes teruggetrokken. Het gehele blootgestelde schedeloppervlak wordt vervolgens voorzichtig met een scalpel afgeschraapt om een droog oppervlak te creëren. Dit is zeer belangrijk, omdat dit de hechting van de lijm zal verbeteren wanneer deze later wordt aangebracht.

Zodra een beeldgevingslocatie is gekozen, kan men overgaan tot het aanmaken van het schedervenster. Met een pneumatische tandartsboor wordt voorzichtig een cirkel met een diameter van ongeveer vier millimeter getekend. Na een korte boring wordt er opnieuw een lidocaïne-epinefrine-oplossing op het schederoppervlak aangebracht.

Het boren wordt gestopt wanneer er een zeer dunne laag bot overblijft, meestal ter dikte van een haar. Deze fase wordt bereikt door zachtjes op het centrum van de craniotomie te drukken om te voelen hoe het toegeeft onder een druppel zoutoplossing en door gebruik te maken van de bottrabekel, een sponsachtige botstructuur.

De craniotomie wordt met pincetten met een zeer dunne punt van de schedel getild. De zoutoplossing is belangrijk omdat deze helpt de schedel op te tillen en bloedingen van de dura voorkomt. Vervolgens wordt gelfoam, die vooraf is geweekt in zoutoplossing, op de dura mater aangebracht om eventuele kleine bloedingen te stoppen die soms optreden wanneer de schedel wordt verwijderd.

Nadat het oppervlak van de dura mater is gedroogd en is vastgesteld dat er geen bloedingen zijn, wordt een steriel glazen dekglas van vijf millimeter voorzichtig op de dura mater geplaatst. Een druppel cyanoacrylaatlijm wordt aangebracht op de tegenoverliggende hemisfeer van de schedel. Met behulp van een naald wordt de lijm voorzichtig rondom het venster aangebracht, waarbij erop wordt gelet dat er geen lijm onder het glas terechtkomt.

Lijm kan nu in een dunne laag over het gehele oppervlak van de schedel worden aangebracht. Zodra de lijm is opgedroogd, wordt tandheelkundige acryl gemengd en over het gehele schedeloppervlak aangebracht, waarbij ook een kleine rand van het dekglas wordt bedekt om dit te fixeren. Na het fixeren van het dekglas wordt met tandheelkundige acryl een klein reservoir rond het venster gemaakt.

Een titanium staafje wordt eveneens in de dentale acrylaat ingebed. Deze staaf wordt later gebruikt om de muis stevig op de tafel van de microscoop te bevestigen. Voor de beeldvorming is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de staaf waterpas staat, zodat deze parallel loopt aan een craniële window.

Door een stuk papier onder de staaf te plaatsen, kan de staaf waterpas blijven terwijl het acryl uithardt; de dentale acryl krijgt 10 minuten de tijd om te uitharden, waarna de titanium staaf op zijn plaats is gefixeerd. Het dier wordt vervolgens in een warme kooi geplaatst totdat het volledig bijna is. Na het herstel van de anesthesie kan het dier op dezelfde dag worden in beeld gebracht.

Deze video toont een stapel van 160 beelden, genomen met intervallen van vijf micron met onze op maat gebouwde tweefotonmicroscoop via een cranieel venster dat over de somatosensorische cortex van een driemaandsoude GFPM-muis is geplaatst. Deze transgene lijn muizen tot expressie brengt GFP in een kleine subset van parvalbumine-neuronen. In laag vijf en laag twee-drie werd de opname gemaakt met een 40x waterimmersie-objectief met een numerieke apertuur van 0,8, gebruikmakend van een excitatiegolflengte van 910 nanometer.

In de meer oppervlakkige beelden zijn de dendritische vertakkingen van de apicale dendrieten van de parametale cellen gemakkelijk te herkennen. De apicale pluim van de dendrieten van elk neuron convergeert in één enkele grote apicale dendriet. Kleinere schuine dendrieten die vanuit deze hoofdapicale dendriet ontspringen zijn ook zichtbaar, evenals axonen die het gezichtsveld kruisen.

Dit is een stapel van 12 beelden, waarbij elke anderhalf micron is vastgelegd met dezelfde 40 x objectief bij een hogere vergroting; een oppervlakkige dendriet wordt getoond met een resolutie die hoog genoeg is om individuele dendritische stekels te onderscheiden. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een craniale window-preparaat uitvoert voor chronische beeldvorming van de hersenen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een uiterst krachtige methode voor het bestuderen van de hersenen, omdat het u in staat stelt om zowel de structuur als de functie van de levende hersenen te bestuderen, niet alleen in een enkele beeldvorming, maar ook chronisch via meerdere beeldvormingen over perioden van maanden.

Een ander voordeel van de voorbereiding van het craniaal venster is dat een groot gezichtsveld kan worden afgebeeld, waardoor het mogelijk is om grote structuren zoals een volledig axon of de dendritische boom over een afstand van millimeters in beeld te brengen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om onder zo schoon en steriel mogelijke omstandigheden te werken en een zeer vaste hand te hebben. Oké, en dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.