De beoordeling van de hartfunctie en Energetica in geïsoleerde Mouse Hearts gebruik ³¹ P NMR-spectroscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de hartfunctie en energetica in een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart te observeren. Dit wordt bereikt door een muizenhart te perfunderen in LOR-modus. Met Krebs-buffer, verrijkt met glucose en pyruvaat als tweede stap, wordt een watergevulde ballon in de linker ventrikel of lv geplaatst, wat een constante monitoring van de hartfunctie tijdens het experiment mogelijk maakt.

Vervolgens wordt het hart in een NMR-buis van 10 millimeter geplaatst en in de magneet ingebracht om de cardiale energetica te beoordelen door de resonanties van fosfocreatinefosfaten van een TP te observeren, waarbij de anorganische fosfaatresultaten werden verkregen die de cardiale functie en energetica aantonen op basis van de LV-drukstroomgolven en P 31 en massaspectroscopie p. Hallo, ik ben Steve Kitz van het MIT Cadre Metabolism Center in de afdeling Anesthesiologie van de University of Washington. Vandaag laat ik u een procedure zien voor geïsoleerde hartperfusie gecombineerd met 31 PNMR-spectroscopie.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de hartfunctie en energetics in onze bio-engineered muismodellen te beoordelen. Laten we beginnen. Om dit protocol te starten, bereidt u één liter Krebs-Henseleit of KH-buffer.

Introduceer 5% koolstofdioxide en 95% zuurstofbubbels in het mengsel gedurende 10 tot 15 minuten. Voeg vervolgens twee millimolair calciumchloride toe, gevolgd door substraten: 10 millimolair glucose en 0,5 millimolair pyruvaat. Voor deze experimenten worden twee afzonderlijke systemen gelijktijdig gebruikt per acquisitie van P 31-spectra.

Een BRUER 14 T magneet is gekoppeld aan de advanced three console en een computer uitgerust met top spin V 2.1 software voor de beoordeling van de hartfunctie. Een op maat gebouwd hartperfusiesysteem is gekoppeld aan de power lab. Vier 30 data acquisitie.

Uitgerust met de lab chart PRO six software voor data-analyse. Het hartperfusie-apparaat bevat een mini pulse three peristaltische pomp, aangestuurd door een STH pompmodule, die wordt gebruikt om de KH-buffer in het hart te perfunderen. Temperatuurregulatie tijdens het NMR-experiment is cruciaal. Verwarmde circulatoren worden gebruikt om de temperatuur tussen 37,0 en 37,5 °C te houden terwijl het hart zich in de magneet bevindt, waarbij de temperatuur gedurende het experiment wordt bewaakt met een glasvezeltemperatuursensor.

Gedurende het hele experiment worden de LV-druk en de perfusiedruk gemonitord via druktransducers die zijn aangesloten op een datas acquisitiesysteem en worden weergegeven met de bijgeleverde software. Een fysiologische transducer wordt gebruikt om de LV-druk te monitoren en een wegwerpbloeddruktransducer wordt gebruikt om de perfusiedruk te monitoren. Tot slot wordt een navelstreng gebruikt om de verwarmde, zuurstofrijke buffer aan het hart toe te dienen.

Zodra u zich in de magneet bevindt, kalibreert u vóór aanvang van het experiment de druktransducers met de standaarden van de fig moment manometer; plaats deze eerst zonder druk op de transducer om de kalibratie te nulstellen. Pomp vervolgens deze fig mode manometer op tot een hogere druk. Voer deze waarde in het computerprogramma in.

Bevestig vervolgens dat de druktransducers adequaat zijn gekalibreerd door deze fig moment manometer op te pompen tot bekende drukken en deze te verifiëren op het computerscherm. Zodra de druktransducers zijn gekalibreerd, kalibreert u de NMR-probe met een 10 millimeter NMR-buis die een standaardmonster van 150 millimolair natriumfosfaat bevat. Voer de kalibratie uit met behulp van het softwareprogramma TopSpin.

Stel eerst het monster af om de frequentie van de fosforresonantie in te stellen. Shim vervolgens het monster om een homogeen magnetisch veld te creëren. Deze initiële kalibratie verbetert het signaal en verkort de tijd die nodig is om de acquisitieperiode te starten.

Zodra het hart is gepositioneerd binnen de probe om te beginnen met de extractie van het muizenhart, injecteer dan 200 units heparine intraperitoneaal om stolling te verminderen. Dien na vijf minuten 175 mg/kg natriumpentobarbital intraperitoneaal toe. Zodra de muis is geanestheseerd, leg deze dan op de rug en plak de armen en benen vast om het borstgebied bloot te leggen.

Voer een knijptest bij de teen uit om er zeker van te zijn dat de muis volledig is geanestheseerd. Maak een incisie. Open de peritoneumholte en de borstkas met een schaar en gebruik een pincet om de ribbenkast terug te pellen en de borstholte bloot te leggen. Houd het longweefsel vast en til het hart voorzichtig op met een gebogen schaar.

Snijd de grote bloedvaten achter het hart door en ga langzaam richting de kop van de muis totdat het hart is vrijgemaakt. Stop het hart onmiddellijk in ijskoude KH-buffer. Houd de organen op ijs en verwijder snel de longen.

Identificeer de loben van de thymus en pel deze voorzichtig terug om de aorta bloot te leggen. Verwijder vervolgens de thymus. Isoleer tot slot de aorta door al het omliggende weefsel zorgvuldig te verwijderen.

Houd met microsutuurpincetten over het algemeen beide wanden van de aorta vast om het lumen bloot te leggen. Plaats vervolgens de aorta voorzichtig op de canule. Deze is gemaakt van polyetheenbuis met een buitendiameter van 0,965 millimeter.

Houd de aorta op zijn plaats met een microvasculaire klem en knoop snel hechtingen rond de aorta. Verwijder de klem zodra de hechtingen zijn geknoopt. Gebruik de pincet om zorgvuldig te controleren of de canule zich boven de aortawortel bevindt.

Voeg eventuele aanvullende hechtingen toe die nodig zijn om het hart op zijn plaats te houden. Verwijder extra weefsel met de pincet en microschaar. Maak vervolgens een kleine incisie in de linker aurikel.

Houd het hart voorzichtig vast en voer een polyetheenbuisje met een buitendiameter van 0,61 millimeter voorzichtig via het linkeratrium en de linkerventrikelholte in, tot aan de apex. Trim het overtollige buisje. Voer vervolgens een leeggelaten, met water gevulde ballon via het atrium in de linkerventrikel.

Bevestig de ballon met plakband. Verhoog vervolgens geleidelijk de snelheid van de peristaltische pomp om een voldoende doorstroming naar het hart te waarborgen. Ga door met het perfunderen van het hart met KH-buffer met een constante stroomsnelheid van ongeveer twee milliliter per minuut totdat het hart in de NMR-probe is geplaatst.

Knal de LV-ballon op met een klein volume met behulp van een micrometerspuit om te verifiëren dat de LV-druktransducer functioneert voor NMR-spectroscopie. Plaats eerst het hart voorzichtig in een 10 millimeter NMR-buis. Er wordt een brede boar-spinner rond de NMR-buis geplaatst om te helpen de buis in de juiste positie te leiden.

Bevestig de gehele opstelling stevig aan de navelstreng met plakband binnen de probe. Laat vervolgens de navelstreng langzaam in de bovenste opening van de magneet zakken tot de NMR-buis met het hart zich in de spoel van de 10 millimeter NMR-probe bevindt. Zodra het hart de juiste positie in de probe heeft ingenomen, wordt de flow van de parasitairpompo aangepast om een perfusiedruk van 80 millimeters kwik te bereiken.

Handhaaf de perfusiedruk door het hold-mechanisme op de pompregelaar te activeren. Laat het hart 15 tot 20 minuten equilibreren. Pas tijdens de equilibratieperiode het volume van de LV-ballon aan om een einddiastolische druk van 8 tot 10 mmHg te bereiken.

Optimaliseer vervolgens de parameters van de spectrometer om het best mogelijke fosforsignaal te verkrijgen. Stem het NMR-instrument af door de radiopuls in te stellen, zodat de frequentie wordt bepaald waarbij de fosforkern resoneert. Shim vervolgens het monster om het magneetveld homogeen te maken na de equilibratieperiode.

Start de acquisitie van meerdere 31P-NMR-spectra. De acquisitieperiode voor elk spectrum is afhankelijk van de veldsterkte van de magneet, de grootte van het monster en de vereiste signaal-ruisverhouding voor een specifiek experiment. In dit geval worden de spectra verkregen met een magneet van 14 Tesla door het signaal van 256 radiofrequentiepulsen van 20 microseconden te middelen, met een fliphoek van 60 graden en vertragingen van 2,0 seconden.

Dit experiment zal ongeveer 10 minuten in beslag nemen. Een typische maatstaf voor de hartfunctie, de LV-ontwikkelde druk, wordt verkregen door de einddiastolische druk of EDP af te trekken van de systolische druk. Bij een normale C 57 black six muis ligt de LV-ontwikkelde druk van het hart doorgaans tussen 100 en 110 millimeters kwik bij een vaste einddiastolische druk van 8 tot 10 millimeters kwik.

Representatieve stylingcurves zijn weergegeven van controlemuizen en muizen met een aortebandage. De systolische functie wordt weergegeven door de ontwikkelde LV-druk bij toenemende LV-volumes, bepaald op basis van het volume van de LV-ballon. De diastolische functie wordt weergegeven door de EDP bij toenemende LV-volumes.

³¹P NMR-spectra van een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart tonen signalen van fosfocreatinine of PCR, de drie fosfaten van een TP en anorganisch fosfaat of pi. Hier is de PI-piek relatief klein. Dit is kenmerkend voor een aeroob geperfuseerd hart dat is voorzien van pyruvaat of vetzuren.

Naast glucose neemt deze piek toe tijdens perioden van ischemie, terwijl de PCR-piek afneemt. Ik heb u zojuist laten zien hoe u een muizenhart voorbereidt voor perfusie, zodat zowel de hartfunctie als de energetica gelijktijdig tijdens het experiment kunnen worden gemeten. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het hart adequaat wordt geperfuseerd.

Anders zullen uw NMR-gegevens niet betrouwbaar zijn. Dat is alles. Dank u wel en veel succes met uw experimenten.