NADH fluorescentie beeldvorming van geïsoleerde Biventriculaire Werken Rabbit Hearts

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van het metabolisme. Met behulp van NADH-imaging in een werkend hartpreparaat wordt dit bereikt door eerst het konijnenhart te isoleren. De tweede stap van de procedure is het succesvol canuleren van alle vier de hartkamers om een werkend hartmodel te realiseren.

De laatste stap is het opstellen van de beeldvormingsapparatuur en het verzamelen van NADH-gegevens bij verschillende pacing-snelheden. Uiteindelijk kunnen de resultaten metabole veranderingen van het hart aantonen via beeldvorming van fluorescent NADH. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de langstoor retroperfusie, is dat het hart functioneert in zijn fysiologische staat, met een flow in de normale richting en waarbij het hart zelf de druk levert voor de coronaire perfusie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de elektrofysiologie en over de mechanismen van fatale aritmieën. Dit wordt bereikt door een fysiologisch model te bieden om de link tussen het metabolisme van de coronaire doorbloeding en de elektrische activiteit te bestuderen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de stappen voor de canulatie van de vaten en hartkamers moeilijk aan te leren zijn.

Een onjuiste techniek kan het hart beschadigen en de rest van het experiment in gevaar brengen. Spoel vóór het uitvoeren van een experiment alle buizen in de kamers van het werkende hartsysteem om met gezuiverd water, en verwijder vervolgens het water uit het systeem door de pompen te laten draaien. Plaats cellulosemembraanfilters in de lijn van de LOR-perfusiepomp, de linkerhartperfusiepomp en de rechterhartperfusiepomp.

Nadat de perfuse eight aan het systeem is toegevoegd, wordt voor elke druksensor een tweepuntskalibratie uitgevoerd. Schakel het verwarmde circulerende waterbad in dat de watergekoelde buizen en de warmtewisselaars verwarmt. Schakel het waterbad in. Dit wordt gebruikt om de PERFUSE eight te verwarmen.

Zet de pompen aan die het PERFUSE eight in een gesloten circuit laten circuleren, en zet de circulatietank aan om het Perfuse eight te oxygeneren. Controleer of de microvezeloxygenator of hemofilters 95% zuurstof leveren aan het perfuse eight bij 80 kilopascals. Controleer tot slot of de warmtewisselaars de temperatuur van het circulerende perfuse handhaven.

Begin de excisie van het hart bij 37 °C door het werkende hartsysteem eerst in te stellen om te werken onder constante druk in LRF-modus. Stel, nadat het konijn is gesedeerd, de druk van de aorteblokkade in op 50 tot 60.

Injecteer pentobarbital en heparine in ofwel de marginale oorader of de laterale vena saphena aan de binnenzijde van het achterpoot. Zodra het konijn geen pijnreflex meer vertoont, wordt de borstholte snel geopend. Snijd het pericardium door, klem de aorta af en exciseer het hart en de longen.

De longen blijven bevestigd om het isoleren van de longaders te vergemakkelijken. Vul vervolgens een spuit met 60 milliliters per F eight en 200 units heparine. Bevestig een vijf millimeter canule en canuleer de aorta.

Bevestig de aorta aan de canule met zijden hechtingen maat nul. Druk vervolgens langzaam de spuit in om het bloed via het hart uit te spoelen. Stel het werkende hartsysteem in door het hart eerst aan het aortablok te verbinden.

Benader de connector onder een schuine hoek en laat Perfuse eight zachtjes vanuit de connector in de canule druppelen terwijl deze is aangesloten. Dit voorkomt dat er lucht in de aorta terechtkomt, waardoor coronaire embolieën worden vermeden terwijl het hart wordt geperfundeerd in de constante druk- l endorf modus.

Verwijder het vet- en bindweefsel en lokaliseer de volgende vaten: de vena cava inferior en superior, de aorta, de vena cava en de arteria en venae pulmonales. Ligeer vervolgens de vena cava superior.

Knip de longslagader vlak onder het punt waar deze zich splitst in de rechter- en linkerlongslagader. De overgebleven vaten zijn de longaders. Groepeer deze tussen het hart en de longen en ligatureer ze allemaal met één hechting.

Dit is om twee redenen cruciaal. Ten eerste zorgt het afbinden van de vaten die met de longen verbonden zijn ervoor dat er geen lekkage optreedt zodra de canulatie voltooid is. Ten tweede is het belangrijk om beide VNA cavas te isoleren voor de latere canulatie.

Verwijder nu de longen. Maak een gat van passende grootte in de hoek van het linker atriumoor en zorg ervoor dat dit gevuld is met profuse eight. Cannuleer vervolgens het atriumoor terwijl de canule volledig is gevuld met perfuse eight.

Hecht vervolgens, terwijl u het weefsel vasthoudt, de canule aan het aanhangsel. Het weefsel van het linkerauriculaire aanhangsel is uiterst fragiel en kan gemakkelijk scheuren. Daarom is het belangrijk om het linker atrium bij de eerste poging te canuleren, anders is dit mogelijk niet meer haalbaar.

Zet pomp nummer twee aan om flow naar het linker atrium te leveren. Stel de preload tijdens het hele experiment in op een waarde tussen de twee en zes tor. De druk moet mogelijk worden aangepast.

Houd het binnen twee millimeter van de doeldruk. Schakel het hart nu over naar de werkende hartmodus door pompnr. 1, de langendorph-pomp, kortstondig uit te schakelen. Verlaag de aortadruk naar 10 mmHg en verhoog deze vervolgens langzaam tot een bereik van 80 tot 100 mmHg.

Hierdoor kan de aortaklep openen en functioneren zoals onder normale fysiologische omstandigheden. Stel de uiteindelijke afterload-druk in op een waarde die ongeveer 20 mmHg lager is dan de piek-LV-druk, met behulp van een canule die rechtstreeks aan het systeem is bevestigd.

Canuleer het rechteratrium via de vena cava inferior en hecht de canule aan de ader. Voorkom dat er luchtbellen worden geïntroduceerd. Schakel pomp nummer drie in, de pomp aan de rechterzijde, om flow naar het rechteratrium te leveren.

Stel de druk in op ongeveer drie tor. Cannuleer tot slot de rechterventrikel zonder lucht toe te laten en hecht de canule aan de arteria pulmonalis. Hiermee is de biventriculaire canulatie voltooid.

Ga nu over tot de signaalacquisitie. Voer de druktransducerkatheter voorzichtig via de aortacannule in de aorta in. Navigeer deze voorzichtig langs de aortaklep en in de lv.

Het LV-druksignaal zal zoals verwacht verschijnen wanneer de katheterpunt correct is gepositioneerd. Druk vervolgens de elektrode voor het monofasische actiepotentiaal voorzichtig tegen het ventriculaire epicardium. Een lichte bewegingsartefact in het electrodesignaal is normaal.

Plaats vervolgens een bipolaire stimulatie-elektrode op het rechteratrium om het hart te pacen volgens de positie in het experimentele ontwerp. Focus de CCD-camera op het interessegebied van het hart. Er moet een emissiefilter aan de camera zijn bevestigd.

Schakel de omgevingsverlichting uit om het epicardium gelijkmatig te verlichten met een UV-lichtbron bij het werkstation waaraan de camera is bevestigd, om de NADH-fluorescentie vast te leggen. Stel de software zo in dat er beelden worden opgenomen met een snelheid van twee frames per seconde. Selecteer vervolgens de modus voor live-updates om de gemiddelde pixelintensiteit binnen het interessegebied te monitoren.

Indien de perfusie adequaat was, moeten de NADH-niveaus, weergegeven door de fluorescentie, laag en stabiel zijn over het epicardiale oppervlak. Beëindig nu het experiment zodra dit is voltooid. Verwijder het hart.

Spoel de PERFUSE eight en de systeemslangen en kamers af met gezuiverd water. Spoel het systeem periodiek om met mucosale TM-oplossing of een verdunde waterstofperoxide-oplossing volgens het beschreven protocol. De harten werden gepaceerd met cycluslengtes tussen 200 en 400 slagen per minuut.

De diastolische LVP lag gewoonlijk tussen 0 en 10 Torr; de minimale diastolische aortadruk was ongeveer 60 Torr. De piek systolische LVP is afhankelijk van de vullingsdruk en contractiliteit en zou optimaal tussen 60 en 80 Torr moeten liggen. De maximale aortadruk en maximale LVP zouden nauw op elkaar moeten aansluiten. Monofasische actiepotentialen die typerend zijn voor het hart van een konijn hebben een snelle depolarisatiefase en een karakteristieke repolarisatiefase. Actiepotentialen konden eenvoudig worden geregistreerd vanuit de preparaten, maar vertoonden gewoonlijk een klein bewegingsartefact tijdens de diastole.

Gemiddelde fluorescerende NADH-waarden uit een interessegebied in het rode kader werden gemeten om veranderingen in de mitochondriale redoxstatus te monitoren tijdens drie pacingcycli bij cycluslengten van 300, 200 en 150 milliseconden, waarbij de pacingfrequentie dicht bij het sinusritme lag. Het baseline NADH-niveau bleef relatief constant naarmate de cycluslengte werd verkort. Onder de 300 milliseconden namen de baseline NADH-niveaus toe, met de grootste toename bij 150 milliseconden; het signaal oscilleert met de contractie en de oscillatiefrequentie komt overeen met de hartslag.

De amplitude van deze oscillaties was altijd kleiner dan elke trend op een langere tijdschaal veroorzaakt door ischemie of hypoxie. Hoge-resolutie fluorescentie-NADH-beeldvorming van het volledige anterieure oppervlak bij 200 slagen per minuut was constant en ruimtelijk homogeen bij 400 slagen per minuut. NADH-niveaus namen aanzienlijk toe in het gehele epicard.

Er werd een significante ruimtelijke heterogeniteit waargenomen, waarbij de grootste toenames plaatsvonden binnen de septale regio's van de RV en LV. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan 45 minuten worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te voorkomen dat er luchtbellen in de aorta of het linker atrium terechtkomen na deze procedure.

Aanvullende methoden, zoals het laden van het hart met een spanningsgevoelige kleurstof, kunnen worden gebruikt om extra vragen te beantwoorden, zoals het koppelen van de elektrische en metabole activiteit op het hartoppervlak tijdens pathologische scenario's zoals lokale ischemie na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de cardiale fysiologie om het hartmetabolisme en geleidingsstoornissen tijdens pathologische aandoeningen te bestuderen met behulp van een fysiologisch relevanter model.