Pseudofracture: Een acute perifere Tissue Trauma Model

Wanneer een lang bot, zoals een femur of tibia, gefractureerd raakt, worden het beschadigde spier- en zacht weefsel blootgesteld aan beschadigde botfragmenten en beenmerg. Dit wordt gevolgd door een sterke immuunrespons om het weefselherstel te ondersteunen. Een model om de effecten van deze blootstelling te bestuderen kan worden gegenereerd door beide femurs en tibia te oogsten.

Afkomstig van een donormuis. De botten worden verbrijzeld om een botoplossing te maken, die vervolgens in het beschadigde dijbeen van een ontvangermuis wordt geïnjecteerd. Vervolgens worden immuunresponsen gemonitord en letsels aan afgelegen organen beoordeeld om de langetermijneffecten van trauma door fracturen te bestuderen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor perifeer weefseltrauma, zoals het bilaterale femurfractuurmodel, is dat dit model, het pseudo-fractuurmodel, langdurige overleving mogelijk maakt zonder complicaties door langdurige anesthesie of complexe fractuurfixatietechnieken, en daardoor de studie van immuunresponsen op de lange termijn na een trauma toestaat. Bereid vóór aanvang van de procedure de volgende benodigdheden voor: een ijsemmer, Betadine, chirurgische instrumenten, GRE-hemostaten, een vijzel en stamper, pincetten, naalden van 20 gauge, een spuit van 1 CC, PBS, anesthesie en een isofluoraan-neuskegel. Eén geëuthanaseerd dier met overeenkomstige leeftijd en gewicht.

Een genetische donormuis moet voldoende materiaal leveren voor drie ontvangers. Plak de donor vast op een plexiglasplaat, waarbij u ervoor zorgt dat de onderste extremiteiten alleen bij de punt van de voet worden vastgeplakt. Scheer de onderste extremiteiten voorzichtig.

Bedek ze vervolgens volledig met Betadine en alcohol voor de steriliteit om de lange beenderen uit de onderste extremiteit te verwijderen, maak een chirurgische incisie in de huid van de liesstreek en snijd de huid verder langs de lengte van de extremiteit tot aan de enkel, trek de huid terug en disseceer deze weg van de subcutane fascia en spieren, zowel aan de mediale als laterale zijde. Steek vervolgens één blad van de schaar onder de spieren die anterior en lateraal van de tibia liggen. Schuif het blad proximaal en distaal om de spieren schoon van het onderliggende bot los te tillen.

Herhaal deze techniek aan de posterieure en mediale onderzijde van de tibia om de spieren onder de tibia te scheiden. Er moet minimale extra kracht worden uitgeoefend aan de posterieure zijde bij het distaal verschuiven om de fibula aan het proximale uiteinde van deze beenspieren los te maken van de tibia. Snijd de pezen zo dicht mogelijk bij hun aanhechtingspunten door en trek de spieren distaal terwijl u de spiergroep gezamenlijk naar beneden trekt; een klein rukje zal de distale aanhechtingen aan het enkelgewricht losmaken. Gebruik een schaar om door het enkelgewricht te knippen.

Koppel de tibia op dit punt nog niet los van het femur; deze verbinding biedt extra hefboomwerking die helpt bij het dissekeren van het femur uit het heupgewricht. Gebruik een soortgelijke techniek om de spieren van het femur te bevrijden. Voer dit posterieur uit en, indien nodig, zowel mediaal als lateraal.

Snijd de distale aanhechting van deze spiergroepen door om ze los te maken van het kniegewricht. Verleng de huidincisie indien nodig om voldoende blootstelling te bereiken en volg de weg onder de spieren. Om het uiteinde van het femur uit het heupgewricht te dissekeren, verwijdert u het femur en de aangehechte tibia van de donormuis en plaatst u deze op steriel gaas.

Scheid de twee botten bij het kniegewricht door elk bot met een aparte hand vast te pakken en de twee botten voorzichtig in tegenovergestelde richtingen langs hun lengte-assen te draaien of roteren. Om de resterende peesaanhechtingen van de lange botten te verwijderen, wikkel je een gaasje van vier bij vier rond de lengte van het bot. Pak dit stevig vast en schraap meerdere keren over de volledige lengte van de botten om de resterende weefsels van het oppervlak te verwijderen.

Plaats de verzamelde botten in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter op ijs. Transporteer de donorbotten naar een grondig gedesinfecteerde biologische veiligheidskast voor de bereiding van de botoplossing.

De zuurkast dient te worden voorbereid met een steriel velddressing, een steriele vijzel en stamper, een steriele pincet, een steriele buis van 8 ml, steriele PBSA, een pipet van 1 ml met de bijbehorende pipetpunten, een 100 µL micropipet met bijbehorende punten, spuiten van 1 ml en naalden van 20 gauge. Breng met de pincet de botten over in de vijzel en gebruik de stamper om de botten voorzichtig te verbrijzelen. Pipetteer 1 ml PBS in de vijzel en blijf de resterende fragmenten verbrijzelen met draaiende bewegingen om een volledige suspensie te waarborgen.

Voeg vervolgens nog een milliliter PBS toe en ga door met vermalen om de botoplossing te maken, die een roze kleur moet hebben. Giet de oplossing langzaam uit de vijzel in de buis van acht milliliter, waarbij u ervoor zorgt dat eventuele grotere resten achterblijven. Overbreng de botoplossing naar een spuit van een milliliter.

Met een naald van 20 gauge moet de botoplossing op ijs blijven. Pipetteer één microliter van de botoplossing op een MacConkey-plaat en verspreid dit gelijkmatig over het oppervlak. Incubeer de plaat gedurende 24 tot 48 uur om de steriliteit te waarborgen.

Begin de chirurgische procedure voor zachte weefselbeschadiging en botoplossingsinjectie door de diepte van de anesthesie van een met pentobarbital geanestheseerde muis te beoordelen via de tenenknijptest. Plaats de muis in rugligging op een plexiglasplaat en immobiliseer het dier door dunne stroken tape met de plakzijde naar buiten losjes rond het distale deel van elke extremiteit te wikkelen. Scheer de abdominale, inguinale en dijregio's van het dier met een trimmer met een mesje van maat 40.

Verplaats de muis naar het steriele operatieveld. Veeg het operatiegebied schoon met Betadine. Veeg daarna met alcohol om het te steriliseren.

Plaats een neuskegel op de muis met daarin een stukje gaas met één milliliter 99% isofluoraan. Zodra de ademhaling van het dier begint te vertragen, wordt de neuskegel verwijderd. Indien gedurende een deel van de procedure aanvullende anesthesie nodig is, kan er extra pentobarbital worden geïnjecteerd of isofluoraan worden toegediend.

Vouw vervolgens een steriel velddressing en drapeer dit over de muis, zodat alleen de onderste ledematen en de kop zijn blootgesteld. Deze weke delen letsel is een bilateraal verbrijzelingsletsel van de achterpoten. Zorg ervoor dat de muis zodanig is gepositioneerd dat de achterpoten licht abduceren en lateraal geroteerd zijn.

Dit helpt bij de toegang tot de juiste spier. Groepeer de knieflexoren om de verbrijzelingsletsel toe te brengen. Klem een grote hemostat van 18 centimeter rond het midden van de musculatuur aan de achterzijde van het dijbeen, met de convexe kromming naar het femur gericht. Vergrendel de hemostat slechts bij de eerste klik voor 30 seconden.

Steek de naald twee tot drie millimeter door de huid, zodanig dat de punt van de bevel net het femur raakt. Injecteer 0,15 milliliter van de botoplossing in de geplette dijspieren aan elke zijde. Trek de naald terug en plaats snel een steriele, met een handschoen bedekte vinger over de injectieplaats om elke terugstroom van de botoplossing uit de wond te voorkomen.

Houd deze vinger enkele seconden vast. Plaats de muis terug in de kooi en sta direct volledige bewegingsvrijheid toe zodra de anesthesie uitwerkt. Passende pijnbestrijding moet worden toegediend terwijl de muis ontwaakt.

Dit algemene schema toont de bifasische immuunrespons na trauma op het tijdstip nul. Er wordt trauma geïnduceerd. Dit wordt gevolgd door een vroege hyperinflammatoire respons die een piek bereikt na zes uur en wordt gemeten via de beoordeling van systemische inflammatie en remote orgaandysfunctie.

Het tweede onderdeel van de immuunrespons na een trauma is een vertraagde immunosuppressie, gemeten aan de hand van immuunceldisfunctie, en wordt weergegeven als een dal rond 48 uur. Dit is een representatief diagram van de inflammatoire cytokinerespons in plasma die vroeg na een trauma optreedt en een voorbeeld is van systemische inflammatie. Disfunctie van afgelegen organen, gemeten via leverschade, blijkt in een soortgelijk tijdsbestek verhoogd te zijn.

Dit representatieve diagram is een voorbeeld om immuunceldysfunctie laat na een trauma te belichten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gedurende het gehele experiment steriliteit en precieze manipulatie te waarborgen. Dit is geen model van een werkelijke fractuur of van een wondinfectie.