Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Onze visuele ervaring begint wanneer het visuele pigment in onze retinale fotoreceptoren fotonen van lichtenergie absorbeert, wat uiteindelijk leidt tot de sluiting van cyclisch nucleotide-gestuurde kanalen in het celmembraan. Dit onderdrukt de afgifte van de neurotransmitter glutamaat door zowel staafjes als kegeltjes. Het vrijgekomen glutamaat wordt waargenomen door stroomafwaartse retinale cellen om de stroomafwaartse signalen te bestuderen.

De ogen worden verwijderd uit een geëuthanaseerde muis. De S worden geïsoleerd, ingebed in een agarblok en gesneden met een vibrerende microtoom. Vervolgens worden de retinaalplakjes onder een microscoop geplaatst en gestimuleerd met LED-verlichting.

Tijdens dit proces worden patchclamp-metingen uitgevoerd om de gegenereerde synaptische stromen of potentialen te meten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de extra complexiteit van het werken in het donker. Het kunnen visualiseren van het gehele proces geeft daarom een gevoel dat anders moeilijk te beschrijven is.

Begin deze procedure door de registratie- en referentiedradelektroden die gebruikt zullen worden te voorzien van een laag zilverchloride. Dompel de elektroden in één molar natriumchloride. Zet vervolgens, met behulp van een spanningsbron van 15 volt met een sinusgolf van één hertz, gedurende ongeveer 20 seconden een spanning van 15 volt tussen de elektroden.

Bereid met een micropipetten-trekker patchpipetten voor van vuurgepolijst BO-silicaglas en kies een pipetpuntweerstand op basis van de grootte van de doelcellen; voor cellichamen met een diameter van ongeveer 20 micron. Gebruik een pipet met een puntweerstand van 5 tot 10 megaohm voor cellichamen. Gebruik voor cellichamen met een diameter van ongeveer vijf micron een puntweerstand van 12 tot 15 megaohm.

Om de grounding-referentie-elektroden voor te bereiden, gebruik een spuit om polyethyleenbuisjes te vullen met een 3,5% agaroplossing bereid in één millimol natriumchloride. Bereid vervolgens de volgende oplossingen volgens de instructies in het bijbehorende geschreven protocol: de externe badoplossing, de snijoplossing, de interne vullingsoplossing van de kaliumaspartaatpipet en de agar-stop.

Bewaar alle oplossingen bij vier graden Celsius tot ze nodig zijn. Voeg op de dag van het experiment ongeveer 1,5 milliliter interne kaliumaspartaatoplossing toe. Voeg vervolgens verdunde Fluor toe.

Giet ongeveer 50 milliliters AIMS-medium met natriumbicarbonaat in de lichtdichte bewaarcontainer. Verbind de plastic slang met een gasfles die 5% carbon dioxide en 95% oxygen bevat om het AIMS-medium te equilibreren met het gas, en plaats de container vervolgens in een waterbad van 30 tot 32 degrees Celsius. Vul daarna een fles met 110 milliliters AIMS-medium met HEPES en plaats deze op ijs.

Equaliseer het medium door de oplossing te beluchten met 100% zuurstofgas. Plaats het resterende aimes-medium dat natriumbicarbonaat bevat in een verwarmd reservoir bovenop de kooi van Faraday. Wikkel parafilm rond de slang en de flesdop om gas in de ruimte boven de oplossing vast te leggen en te equilibreren met 5% koolstofdioxide en 95% zuurstofgas.

Bereid met een glazen luchtdispersiebuis 3% agar met een lage geleringstemperatuur door 0,75 gram toe te voegen aan 25 milliliters aims-medium onder verhitting. De oplossing wordt ongeveer 115 °C terwijl er geroerd wordt. Wanneer de oplossing helder wordt en er geen bellen meer zichtbaar zijn, wordt de gesmolten agarsolutie in een waterbad van 42 °C geplaatst.

Stel de registratiekamer op de omgekeerde microscoop in. Schuif een agarbrug van vijf centimeter over de zilver/zilverchloride-referentie-elektrode en plaats deze in de registratiekamer. De weerstand van de pipetpunt kan worden gemeten door een pipet te vullen met interne oplossing, deze in de pipethouder te plaatsen, de pipethouder in de amplifier head stage te zetten en de pipet in de oplossing te laten zakken. Om het visuele pigment voor fysiologische registraties te behouden, moeten alle procedures onder infrarood licht met behulp van een infraroodbril worden uitgevoerd, hoewel alle procedures hier bij kamerlicht worden getoond.

Nadat de muis is geëuthanaseerd, worden de ogen snel verwijderd met een gebogen schaar. Plaats de ogen op een stuk filterpapier om te voorkomen dat ze wegrollen. Houd vervolgens een oog op zijn plaats met een pincet en maak met een dun dubbelzijdig mesje een insnijding in het hoornvlies.

Zodra de oogbol is doorprikt, wordt het oog overgeplaatst naar een Petrischaal van 60 millimeter gevuld met aims-medium. Gebruik de opening in het hoornvlies als toegangspunt en gebruik een kleine schaar om de resterende delen van het hoornvlies weg te knippen.

Verwijder vervolgens de lens en het glasvocht, waarbij u erop toeziet dat het netvlies aan de oogcup bevestigd blijft. Plaats dit in een lichtdichte container gevuld met aims-medium, geëquilibreerd met 5% koolstofdioxide in 95% zuurstof bij 32 °C.

Snijd vervolgens de volgende hemisectie van een van de oogbekers met een scalpelblad nummer 10. Scheid het netvlies van het retinaal pigmentepitheel.

Verwijder de randen van het netvlies zodat het weefsel plat kan liggen. Gebruik een kleine glazen Pasteurpipet met een latex ballon om een Petrischaal van 35 millimeter te vullen met gesmolten agar met een lage geleringstemperatuur en trek de pincet door de agar om de consistentie te testen. Zodra de agar begint te stollen, wordt het netvlies op de agar geplaatst.

Absorbeer vervolgens met een gedraaid stukje Kimwipe de overtollige oplossing rondom het netvlies, zonder het netvlies aan te raken. Plaats twee tot drie extra druppels agar direct op het netvlies en plaats snel een plastic cilinder om een wand eromheen te vormen. Terwijl het netvlies nabij het centrum van de cilinder wordt gehouden, druppelt u extra gesmolten agar in en plaatst u de Petrischaal in een ijswaterbad om af te koelen. Verwijder na 30 seconden het weefsel en gebruik een zuiger om het agablok uit te drukken, waarbij u vanaf de zijde duwt die het verst van het netvlies afligt.

Gebruik een eenzijdig scheermesje om een klein blokje agar met daarin het netvlies uit te snijden en lijm dit blokje met secondelijm op zijn plaats tegen de agar-stop op de specimen-schijf. Plaats de specimen-schijf in de vibratiomicrotoomhouder en giet ijskoude AIMS-oplossing in de houder, zodat het blokje met het netvlies volledig ondergedompeld is. Snijd netvliessneden met een dikte van ongeveer 200 microns met de maximale vibratiesnelheid van het mesje, waarbij de voorwaartse snelheid van het mesje zo is ingesteld dat het vier tot vijf seconden duurt om één keer door het netvlies te snijden.

Gebruik een scalpelmesje nummer 11 om elke bruikbare plak één voor één uit het blok te snijden. Plaats de plakken die het netvlies bevatten in registratiekamers en klem deze vast. Gebruik slice-ankers om de nylon draden over de plak te spannen.

Houd de agar rondom het netvlies vast, zodat het netvlies onbelemmerd blijft. Voor opnames: verplaats de opnamekamer naar de tafel van de rechtopstaande microscoop.

Sluit het gordijn en schakel de infrarode lichtbron in om de slice te bekijken met een infraroodgevoelige camera. Identificeer onder de microscoop een retinale slice met intacte fotoreceptoren onder de juiste snijhoek. Er kan enige oppervlakkige schade zichtbaar zijn als gevolg van het snijproces.

Gebruik een pipet met een afgebroken punt om de dode cellichamen voorzichtig weg te zuigen. Om deze dunne cellaag te verwijderen, zodra een gezonde laag levende cellen zichtbaar is, identificeert u een cellichaam dat zich in de gewenste strata bevindt. Beweeg de pipetpunt zodanig dat deze het celmembraan indrukt en oefen een lichte negatieve druk (naar binnen) uit om een hoogwaardige afsluiting te creëren. De whole-cell modus kan worden bereikt door negatieve druk op de elektrode uit te oefenen om in de cel door te breken.

Stimuleer vervolgens het retinale weefsel met licht met behulp van LED's om reacties op te wekken. Leg aan het einde van de registratie een beeld vast met het juiste excitatielicht voor de fluorofoor die vanuit de interne vloeistof van de pipet in de cel is gedialyseerd. Hier worden lichtgeëvoceerde potentialen van een donkergeadapteerd retinaal neuron getoond bij lichtflitsen van toenemende intensiteit.

Deze figuur is een fluorescentiebeeld van een retinaal plakje waarin de cellen zijn gevuld met Fluor Lucifer yellow; de opgewekte fluorescentie toont de morfologie van de cellen waarvan patch-registraties zijn gemaakt. Na het bekijken van deze video zou u een beter inzicht moeten hebben in enkele van de complexiteiten van het maken van patch-clamp-registraties van donkergeadapteerde retinaal plakjes. Het doel van deze procedure is het meten van lichtopgewekte responsen onder gecontroleerde verlichting.

Om dit te doen, moeten we eerst het netvlies isoleren, dit in agar inbedden en vervolgens netvliescoupes maken waarmee we single-cell registraties kunnen uitvoeren.