Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca ^{2 +} Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van in agar ingebedde retina-plakjes voor de studie naar de microcircuits die zich bevinden in de presynaptische zenuwuitlopers van bipolaire cellen. Dit wordt bereikt door eerst de retina uit een donkergeadapteerd oog van een goudvis te verkrijgen en een klein rechthoekig stukje van deze retina uit te snijden. Het stukje retina wordt vervolgens ondergedompeld in een transparante agaroplossing met een laag smeltpunt, die vervolgens wordt gestold in een geschikte koude slice-oplossing.

De volgende stap is het snijden van het vaste agarblok met het rechthoekige stuk retina met behulp van een vibratoom. De laatste stap is het visualiseren, identificeren en patchen. Klem een axonale terminal van een bipolaire cel vast.

Uiteindelijk tonen de resultaten de presynaptische calciumstroom en de synaptische fysieke exocytose aan met capaciteitsmetingen van het membraan van vernevelde en intacte bipolaire celterminals. Hallo, mijn naam is Han Kim. Ik ben postdoc in het PCO-lab van het Burham Institute.

Vandaag ga ik de AGA-methode voor de bereiding van ingebedde coupes van de koude faciale retina introduceren en de patchclamp-capaciteitsmeting bij een enkele pijplijn demonstreren. Om deze procedure te starten, wordt elk oog van een goudvis gehalveerd door gelijkmatig rond de voorkant van het oog te knippen met een veerschaar. Plaats vervolgens de oogbekers in gekoelde coupesolutie zonder calcium.

Verwijder indien nodig de lens met een pincet. Verwijder vervolgens het pigmentepitheel dat aan het netvlies vastzit door het netvlies met een fijn pincet met een hoek van 45 graden van de oogbeker af te pellen. Snijd daarna de oogzenuw door met een fijn pincet of veerschaar.

Pas vervolgens zuiging toe met een gemodificeerde Pasteurpipet of een grote transferpipet. Om de retina te verwijderen, verwijdert u voorzichtig het resterende pigmentepitheel dat aan de retina vastzit. Het oppervlak van de gereinigde en gezonde retina moet er glad uitzien.

Behandel vervolgens het geïsoleerde retina gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur met ongeveer 0,03% hoger IDE. Let op dat de procedure voor het verwijderen van het glasvocht bij weinig licht moet worden uitgevoerd. Snijd in de volgende stap een rechthoekig stukje retina van ongeveer twee bij twee millimeter, dat de volledige dikte van het retina bevat, door de gebogen randen met een scheermesje te verwijderen.

Breng vervolgens het stukje retina over naar een klein bakje gevuld met agarose-oplossing en probeer de hoeveelheid oplossing rond de retina te minimaliseren wanneer deze in de vloeibare agarose wordt geplaatst. Dompel de retina met de agarose vervolgens direct onder in de ijskoude slice-oplossing om de agarose te laten stollen. Snijd daarna het gestolde agaroseblok met het rechthoekige stukje retina in een kubus van één bij één bij één centimeter.

Lijm het blok op het oppervlak van de snijplaat in de preco-slicekamer. Snijd het blok vervolgens in plakjes met een dikte van 200 tot 250 microns in de ijskoude slice-oplossing. Met behulp van een vibratoam为止 kan in totaal vijf tot 10 plakjes worden verkregen, die ongeveer vijf tot zes uur levensvatbaar zijn.

Breng daarna een van de coupes over naar de registratiekamer. Plaats een U-vormig platina frame met een raster van nylon draden bovenop de coupe. Perfuseer de coupe continu met een snelheid van één tot twee milliliters per minuut met registratie-oplossing waarin carbogen is gebubbeld.

Gebruik in deze stap een spuit met een filtertip van 0,2 micron om de glazen patchpipet te vullen met interne oplossing tot een niveau van één tot twee centimeter vanaf de achterkant van de pipet. Verwijder vervolgens eventuele luchtbellen uit de tip. Bevestig de pipet in de houder.

Oefen positieve druk uit op de pipet en beweeg deze met een micromanipulator naar het beoogde axonale uiteinde, terwijl u de tip naar beneden door het weefselcoupe beweegt. Beweeg de pipet in een zijwaartse veegbeweging om te voorkomen dat het weefselcoupe wordt meegetrokken met de tip. Beweeg vervolgens de pipetpunt rond het axonale uiteinde om het membraanoppervlak te reinigen.

Duw de pipetpunt naar beneden tegen de rand van de terminal om een inkeping te maken en laat de positieve druk los. Als er niet onmiddellijk een giga ohm-afdichting wordt gevormd, wordt er een lichte negatieve druk op de pipet uitgeoefend. Zodra er een giga ohm-afdichting is gevormd, wordt de E PC nine patch clamp-versterker overgeschakeld naar de onsell-opnamemodus en wordt het rustpotentiaal gewijzigd naar minus 60 of minus 70 millivolt.

Pas de snelle capaciteitscorrectie toe en wacht tot de seal stabiliseert tussen 5 en 10 giga ohm. Ruptureer vervolgens het membraan met een korte, zachte zuigkracht om de whole cell recording-configuratie te vestigen.

U kunt ook mondzuiging gebruiken in plaats van een spuit. Nadat de whole-cell configuratie is vastgesteld op een geatomiseerde MB-terminal, brengt u een stapdepolarisatie van 200 milliseconden aan van min 70 naar nul millivolt. Houd er rekening mee dat er in de voltage-clampmodus vóór en na deze depolarisatie een sinusgolf van twee kilohertz wordt toegepast. Om de membraancapaciteit te meten, maakt de depolarisatie de directe meting mogelijk van binnenwaartse calciumstromen die worden geactiveerd door de opening van voltage-afhankelijke L-type calciumkanalen met een cesiumgebaseerde interne oplossing.

Parallel daaraan kan men de capaciteitssprong volgen die wordt veroorzaakt door de calciumafhankelijke exocytose van synaptische blaasjes, welke het membraanoppervlak vergroot. Als een intacte MB-bipolaire cel wordt gepatcht met de pipet op het synaptische uiteinde, zullen er geen waarneembare calciumstromen worden geobserveerd vanwege de grote lekstromen door de gap junction-koppeling in de dendrieten van de MB-bipolaire cellen. Wat men observeert is een grote uitwaartse lekachtige stroom.

Men is echter nog steeds in staat om de capaciteitssprong te monitoren met een hoogfrequente sinusvormige stimulus die vóór en na de getoonde depolarisatiestap wordt geactiveerd. Hier zijn de voorbeelden van I-R-D-I-C, afbeeldingen van M bipolaire celterminals. De intacte terminals verschijnen waarschijnlijker elliptisch, zoals getoond in A en B, terwijl C de gemixede terminal toont, die rond en cirkelvormig verschijnt.

De methode van kleurstofvulling kan ook worden gebruikt om de celterminalen te classificeren. Hier zijn voorbeelden van fluorescentiebeelden van MBI bipolaire celterminalen met een intact axon in D, een gedeeltelijk doorgesneden axon in e en een volledig verwijderd axon in F. Hun terminaalgebieden worden aangegeven door de blauwe pijlen. Hier worden de directe metingen van calcium-imaging signalen, exocytose en inhiberende feedback getoond.

In een MB bipolaire celterminal werd een kortstondige stijging van de calciumconcentratie in de teleria van een MB terminal geactiveerd door een depolarisatiestap via voltage clamp; de bijbehorende fluorescentieafbeelding van de MB teleria is te zien in B. Voorbeelden van kortstondige synaptische depressie van neurotransmitterafgifte worden getoond in C. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de hoeveelheid oplossing rond de retina te minimaliseren bij het plaatsen in de kit-agar. Dit zal de hechting van de Latinized aan het agarbehandelde blok verbeteren.