Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel

De symptomen van de ziekte van Parkinson, waaronder motorische en spraakfunctiestoornissen, zijn het gevolg van een verminderde activiteit van dopamine-secreterende cellen in de hersenen. Het enterische zenuwstelsel en de bulbus olfactorius zijn de meest blootgestelde zenuwstructuren en de eerste die worden getroffen. De ziekte van Parkinson is in verband gebracht met blootstelling aan pesticiden.

Om de effecten van pesticiden op het enterische zenuwstelsel te analyseren, wordt het pesticide roone via orale gavage aan muizen toegediend. De muizen worden vervolgens intracardiaal geperfuseerd met 4% paraformaldehyde om de hersenen en het enterische zenuwstelsel te fixeren. Het weefsel wordt geëxtraheerd, geprepareerd en immunogekleurd voor de PD-geassocieerde eiwitten.

Afbeeldingen van bèta III-tubuline en alfa-synucleïne, verkregen via confocale microscopie, tonen de accumulatie van alfa-synucleïne binnen neuronen van het enterisch zenuwstelsel in dieren die zijn blootgesteld aan pesticiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals systemische toediening van rotenon, is dat hiermee wordt gegarandeerd dat het effect van rotenon beperkt blijft tot het enterisch zenuwstelsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de ziekte van Parkinson, zoals de etiologie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie ervan.

De implicaties van deze techniek reiken verder dan de therapie en diagnose van de ziekte van Parkinson, omdat ze de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelwitten en diagnostische methoden mogelijk maken. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals het bestuderen van het effect van andere omgevingstoxines op het enterische, sympathische en parasympathische zenuwstelsel, evenals op de darmwand. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden moeite hebben, omdat het enige tijd kost om de gavage onder de knie te krijgen.

Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methoden toen ik las over de link tussen pesticiden en de ziekte van Parkinson. Het was daarnaast nuttig om de conferentie van high CORAs bij te wonen tijdens het World Parkinson Congress in Berlijn in 2005. Een rustige demonstratie van deze methode is noodzakelijk.

De methode om ol via een sonde toe te dienen is moeilijk, aangezien muizen een andere anatomie hebben dan mensen; daarnaast is de beeldanalyse uitgevoerd met aangepaste stappen voor deze beelden. Begin het protocol door het dier te wegen. Bereken het juiste volume rotenon.

Er is 0,01 milliliter per gram lichaamsgewicht van het dier nodig, wat overeenkomt met een dosis roone van vijf milligram per kilogram. Vul een injectiespuit van één milliliter met de roone-oplossing en vul vervolgens een tweede spuit met de vehicle-oplossing. Pak de muis op en houd de staart van de muis met één hand vast.

Span de huid van de nek door deze met de eerste twee vingers van de andere hand naar achteren te trekken. Zodra de kop tussen de twee vingers is gefixeerd, wordt deze tegen de handpalm geleund en ondersteboven gedraaid. Fixeer de staart.

Druk met de ringvinger en de pink, terwijl de kop naar achteren wordt gehouden, op het gehemelte om de bek van de muis te openen. Voer de sonde voorzichtig in de bek in. Beweeg de sonde langzaam in de richting van de maag totdat deze volledig is ingebracht.

Om te voorkomen dat er materiaal in de longen terechtkomt, dient de roone-oplossing of het vehikel te worden toegediend door voorzichtig op de embolus te drukken. Na voltooiing wordt de sonde langzaam verwijderd en wordt het dier teruggeplaatst in een andere kooi totdat alle dieren uit één kooi zijn behandeld. Na de behandeling worden de muizen intracardiaal geperfuseerd met 4% paraformaldehyde.

In PBS worden de darmen vervolgens door dissectie geëxtraheerd en gedurende de nacht geplaatst in 15% sucrose. De volgende dag wordt het weefsel overgebracht naar 30% sucrose en opnieuw een nacht geïncubeerd bij vier graden Celsius. Het weefsel wordt vervolgens in een vriezer van minus 80 graden Celsius geplaatst en bewaard tot gebruik. Met behulp van een cryostaat worden coupes van 20 micron van de darm gemaakt.

Dwarsdoorsneden worden overgebracht naar objectglazen, waarna blokkerings- en immunokleuringsprocedures worden uitgevoerd. Hiervoor worden antilichamen tegen bèta-tubuline 3 en alfa-synucleïne gebruikt. Het wordt aanbevolen dat een externe persoon een blinde analyse van de gegevens uitvoert.

Om met de analyse te beginnen, opent u de Fiji-software. Open het confocale afbeeldingsbestand. Splits vervolgens de kanalen, zodat het mogelijk is om op elk kanaal afzonderlijk te werken.

Sluit de kanalen die niet worden gebruikt en selecteer 'analyze', 'set', 'scale' en stel de pixelgrootte in op één. Stel de bekende afstand in op 0.13 en klik op 'global'. De grootte van de afbeelding wordt nu weergegeven in microns.

Selecteer het alpha-synucleïne-kanaal en selecteer het ganglion. Zorg ervoor dat de selectie het ganglion in alle coupes omvat. Dupliceer de afbeelding met alleen het geselecteerde ganglion; er zal een afbeelding worden gedupliceerd ter grootte van het ganglion.

Druk op 'edit clear'; het gedeelte van de afbeelding buiten het geselecteerde gebied wordt zwart. Dupliceer de afbeelding opnieuw om te bepalen hoe succesvol de procedure was. Afbeeldingen met een lage signaal-ruisverhouding mogen niet worden gebruikt voor beeldanalyse.

Selecteer afbeelding aanpassen drempelwaarde. Selecteer vervolgens maximale entropie. Loop daarna door de coupes in de bijgesneden afbeelding en de oorspronkelijke afbeelding om te controleren of de procedure correct is verlopen.

De tropische drempelwaarde selecteert een intensiteitssignaalniveau op basis van het beeldhistogram, waarbij alleen pixels met intensiteiten boven deze drempelwaarde worden weergegeven in een wit-op-zwart beeldselectieproces. Klik vervolgens op smooth. Deze stap transformeert de gepixelde randen van de beelden in gladde randen in het selectieproces.

Klik vervolgens op 'binary' en kies 'Make binary'. De afbeelding wordt weergegeven als een zwart-wit afbeelding. Om de volgende stap op de gedupliceerde afbeelding uit te voeren, klikt u op 'analyze' en daarna op 'analyze particles'. Selecteer vervolgens 'show outlines' en klik op 'summarize'.

De overige instellingen moeten op de standaardwaarden blijven staan. Deze functie herkent het totale aantal pixels met een signaal en de pixels die samen gegroepeerd zijn als het totale oppervlak van pixels met signaal. Daarnaast worden het aantal pixelgroepen en de gemiddelde grootte gerapporteerd.

Vergelijk en selecteer de slice met het grootste totale oppervlak dat goed is aangepast. De slice wordt gemarkeerd. Kopieer de datatabel met het totale oppervlak van alfa-synucleïne, het aantal inclusies en de gemiddelde partikelgrootte.

Plak de gegevens in een Excel-spreadsheet of noteer ze elders. Keer terug naar Fiji. Zoek de eerder geselecteerde slice in het beta-tubulinekanaal en selecteer deze.

Selecteer het gebied van het ganglion en klik op analyseren. Selecteer vervolgens meten. Er verschijnt een andere tabel waarin het totale oppervlak van het ganglion wordt weergegeven.

Extraheer de gegevens uit de tabel naar een Excel-spreadsheet bij de meting van alfa-synucleïne of kopieer deze elders naar Excel. Deel de verschillende parameters die bij de alfa-synucleïne-meting zijn verkregen door het ganglioppervlak om het totale alfa-synucleïne-oppervlak en het aantal inclusies genormaliseerd naar de gangliogrootte te verkrijgen. Om de effecten van rotenoon die lokaal inwerken op het enterische zenuwstelsel te analyseren, werd 5 mg/kg van het pesticide rotenoon toegediend via orale gavage aan 1 jaar oude C57BL/6-muizen. Het hier getoonde chromatogram laat de aanwezigheid van een rotenoon-piek zien één uur na toediening bij controlemuizen behandeld met 20 mg/kg rotenoon en 5 mg/kg rotenoon.

Rotenonspiegels in bloed- en hersen- en hersenstamextracten werden bepaald via HPLC, zoals hier wordt getoond. Toediening van vijf milligram per kilogram rotenon via orale gavage resulteert, zoals bepaald via HPLC, niet in meetbare spiegels in het bloed één, twee of drie uur na de behandeling. Deze grafiek toont de rotenonspiegels in de hersenen en hersenstam van behandelde muizen.

Eén uur na de extractie toont de toediening van 10 milligram per kilogram of minder rotenon geen rotenonniveaus aan in monsters van de hersenen of hersenstam. Eén uur na toediening werd de activiteit van mitochondriaal complex I beoordeeld in spier- en hersenmonsters van muizen die gedurende 1,5 maand waren behandeld. Er is geen significant verschil tussen de groepen, wat duidt op geen inhibitie van mitochondriaal complex I, waarmee wordt bevestigd dat er geen rotenon in deze regio's aanwezig was.

Analyse van alfa-synucleïne, het Lewy-body-component van de ziekte van Parkinson, na toediening van rone maakt een betrouwbare bepaling mogelijk van de totale hoeveelheid alfa-synucleïne aan het oppervlak, de aanwezigheid van alfa-synucleïne-inclusies en het alfa-synucleïne-patroon in de cel. Deze figuur toont anti-beta-drie-tubuline, alfa-synucleïne en DAPI-kleuring in coupes van het duodenum en ileum, zoals hier te zien is. Een behandeling van 1,5 maand met roach induceerde een verhoogd punctaat patroon van alfa-synucleïne binnen ganglia van het enterische zenuwstelsel, zelfs vergeleken met controles van drie maanden.

Dit patroon kan worden waargenomen in zowel het ileum als het duodenum. Na drie maanden behandeling kan de vorming van grotere alfa-synucleïne-inclusies worden gezien; immunofluorescentiekleuring met anti-alfa-synucleïne, theof, flavine en DPI toont aggregatie van grotere alfa-synucleïne-accumulaties uitsluitend na drie maanden. Dit experiment werd geanalyseerd met behulp van automatische segmentatie en drempelwaardemethoden op basis van entropie.

In de grafiek links stelt elke kolom de totale hoeveelheid alfa-synucleïne op het oppervlak ten opzichte van het ganglioppervlak voor. In de grafiek rechts stelt elke kolom het totale aantal alfa-synucleïne-insluitingen per genomen ganglioppervlak voor. Samen suggereren deze gegevens dat lokale toediening van rotenon fosforylering, accumulatie en aggregatie van alfa-synucleïne induceert, samen met gliose in de ganglia van het enterische zenuwstelsel. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze correct worden uitgevoerd in één minuut per dier.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de sonde voorzichtig in te brengen; indien er weerstand wordt gevoeld, is het raadzaam deze te verwijderen en opnieuw in te brengen volgens deze instructies. Andere methoden, zoals HPLC, immunovleking en beeldanalyse, kunnen worden toegepast. Dit maakt het mogelijk om andere regio's, de effecten van de stof, of zelfs de aanwezigheid van de stof in het bloed na toediening te analyseren.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor neurowetenschappers om de effecten van omgevingsneurotoxines op het enterische zenuwstelsel te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om de gage correct toe te passen en de beelden uit de immunochemie te analyseren. Vergeet niet dat het werken met rotten extreem gevaarlijk kan zijn.

Daarom raden wij het gebruik van handschoenen en maskers aan tijdens het uitvoeren van deze procedure.