Single Cell Transfectie in kippenembryo's
25 september 2010
Met behulp van fijne punt micropipetten we plasmide DNA injecteren in deelgebieden van de kip somieten of neurale buizen. De concentratie van het plasmide is aangepast aan enkele getransfecteerde cellen te genereren. Vervolgens hebben we laten de cellen zich ontwikkelen tot klonale populaties.
Het algemene doel van deze procedure is om individuele cellen van kikensomieten of neurale buizen te injecteren met een plasmide dat codeert voor groen fluorescent proteïne. Dit wordt bereikt door eerst microinjectiepipetten te trekken met een geschikte tipopeningdiameter. De tweede stap van de procedure is het voorbereiden van een plasmide-voorraad voor de injecties.
De derde stap van de procedure is het voorbereiden van de embryo's voor injectie. De vierde stap van de procedure is het vullen van de micropipetten met plasmide-DNA. De laatste stap van de procedure is het injecteren van de gewenste weefsels.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via immunofluorescentiemicroscopie het bereik van derivaten laten zien in het aantal cellen dat wordt geproduceerd door enkelvoudig gelabelde progenitorcellen in gekozen subdomeinen van de somiet en de neurale buis. Hallo, ik ben Rael van het laboratorium van professor Heim van de afdeling Medische Neurobiologie aan de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem. Vandaag laten we u een procedure zien voor het injecteren van enkelvoudige cellen in somieten en neurale buizen van kippen.
We gebruiken deze procedure in het laboratorium om de lijnsegregatie van zo mite en neurale buiscellen te bestuderen. Laten we beginnen. Om enkelvoudig getransfecteerde cellen in kiजembryo's te genereren, begint u met het trekken van micropipetten. We trekken onze pipetten op een standaard Naga PP 83 pipettentrekker met een hitte-instelling van 13,5.
De nauwkeurige instelling moet worden gekalibreerd om een pipetpunt-diameter van tussen 8 en 10 micron te bereiken. Wij maken gebruik van borosilicaatglazen filamentbuisjes met een buitendiameter van 1 millimeter en een binnendiameter van 0,75 tot 0,78 millimeter. U kunt ook commercieel verkrijgbare micropipetten gebruiken, zonder een filament van 1 millimeter buitendiameter en 0,75 millimeter binnendiameter.
De klaargemaakte pipetten worden bewaard in een plastic schaal, waarbij de tips worden beschermd tegen contact met de rand van de schaal. Om het DNA voor micro-injectie voor te bereiden, wordt het plasmide van belang getransfecteerd in DH5α e. coli. Met behulp van standaardprocedures wordt het plasmide de volgende dag gezuiverd met een Maxi prep-kit; voor niet-klonale injecties gebruiken we een DNA-concentratie van 1 µg/µL.
Voor experimenten waarbij individuele klonen gewenst zijn, zal de plasmidconcentratie veel lager zijn en moet deze worden aangepast. Voor P-C-A-G-G-F-P-A werkt een concentratie van 0,05 tot 0,1 microgram per microliter goed. Zodra de optimale concentratie is bepaald, raden wij aan om de gehele gezuiverde plasmidvoorraad te verdunnen tot een vooraf bepaalde concentratie, in plaats van individuele preparaten.
Dat laatste kan leiden tot enige variatie in de succespercentages, waarschijnlijk door verschillen in zuiverheid en andere parameters, zoals de verhouding van supercoiled plasmide. Om kippeneieren voor micro-injectie voor te bereiden, worden eieren die zijn uitgebroed terwijl ze op hun lange as lagen tot het gewenste ontwikkelingsstadium, afgeveegd met 70% ethanol en aan de lucht gedroogd. Doorboor vervolgens het spitse uiteinde van het ei met een chirurgische schaar. Gebruik een spuit van 10 milliliter en een naald van 19 gauge om twee milliliter albumine uit het ei te trekken; verzegel de gaatjes met warme paraffine voorafgaand aan de injectie.
Gebruik een chirurgische schaar om bovenaan de eierschaal een opening te maken om te voorkomen dat vuil in het gat terechtkomt. Plak een stuk plakband over de opening en snijd hierdoorheen een gat. Om het embryo beter zichtbaar te maken, wordt een vlamgetrokken capillair op een aspirator gebruikt om een niet-toxische inkt, zoals pelican 17, onder de geblastte derm injecteren.
Toegang vervolgens tot het embryo door de vitelline en/of amniotische membranen door te snijden en te verschuiven met insectenspelden van 0,14 millimeter in een naaldvoerder, om het DNA in de uitgetrokken Eloqua-pipet te laden, en voeg met de capillair een kleine hoeveelheid fast green-poeder toe. Zuig een minimale hoeveelheid plasmide op met een capillair van passende diameter met behulp van een aspirator. Steek deze vervolgens in het uiteinde van de pipet tegenover de scherpe punt en laad het DNA zo dicht mogelijk bij het scherpe uiteinde.
Bevestig vervolgens de pipet aan een handmatige luchtdrukspuit die is gemonteerd op een micromanipulator. Oefen indien nodig een minimale hoeveelheid druk uit zodat de plasmidoplossing de tip van de pipet bereikt. Manipuleer de pipet in het vloeibare medium van het ei, terwijl er enige luchtdruk wordt uitgeoefend om verstopping van de pipetpunt te voorkomen.
Zodra het relevante weefseldomein is doorboord, is de drukverandering vaak voldoende om het plasmide met zichtbaar fast green vrij te geven. Als dit niet gebeurt, oefen dan lichte druk uit op de spuit totdat het plasmide-fast green-mengsel wordt uitgestoten. Herhaal deze procedure langs de as van het embryo; na de injectie kan PBS worden toegevoegd.
Sluit tot slot het venster af met plakband en plaats de eieren terug in de incubator. Vermijd ventilatie en plaats kleine bakjes water in de incubator om het vochtgehalte te helpen handhaven en de opbrengst te verhogen. Als de injectieplaats oppervlakkig genoeg was om direct zichtbaar te zijn, zoals in de neurale buis van de dorsale somieten of het ectoderm, kan het succespercentage van het experiment worden gemeten door een whole mount-observatie uit te voeren met een fluorescente binoculaire microscoop.
Deze stap is bijzonder nuttig om te beoordelen of er te veel of te weinig cellen zijn gelabeld. Indien verdere incubatie gewenst is, voeg dan na observatie een PBS-oplossing met antibiotica toe aan het ei en breng de plaktape aan de bovenzijde opnieuw aan. Daarnaast kan het succespercentage van de injectie worden bepaald door de embryo's seriële doorsneden te laten maken en immunohistochemie uit te voeren.
Na vier uur of langer na de injectie worden de embryo's gefixeerd en verwerkt voor paraffine-insnijding. De op glas gemonteerde coupes worden vervolgens gedeparaffineerd en immuunkleurig gemaakt voor visualisatie van de reporter; amplificatiemethoden zoals biotine-streptavidine kunnen wenselijk zijn. Ten slotte worden de seriële coupes gescand om gelabelde cellen in de geïnjecteerde segmenten te detecteren.
Als er bij de eerste pogingen meerdere in plaats van enkele cellen worden verkregen, moet de plasmidvoorraad worden verdund en het proces worden herhaald totdat adequate resultaten worden behaald. Wij voeren doorgaans een enkele injectie van P-C-A-G-G-F-P per somiet uit, waarbij we zes tot 12 segmenten per embryo targeten. Bij deze instelling kan acht uur na injectie een duidelijk signaal worden gedetecteerd door whole mount observatie in ten minste één segment in één op de 10 embryo's.
In dit voorbeeld werd een so-miet geïnjecteerd met een GFP-coderend plasmide, en vijf uur later is een enkele fluorescerende cel waarneembaar in een whole-mount weergave van het hier getoonde embryo. Bij observatie 24 uur na injectie in de centrale so-miet is er, twee dagen na de clonale injectie, een kloon van fluorescerende cellen waarneembaar in een whole-mount embryo. Secties van dit segment onthullen de aanwezigheid van clonale nakomelingen in zowel de dermis als de spieren, wat aantoont dat enkele progenitoren beide derivaten genereren.
Net als bij somieten kunnen ook individuele neuro-epitheliale progenitorcellen in de dorsale neurale buis worden gepenetreerd, zoals geïllustreerd in deze transversale doorsnede, gefotografeerd vijf uur na injectie. Analyse van seriële coupes onthulde dat clonale transfecties werden bereikt bij een succespercentage van ongeveer 10%. Dit betekent dat de techniek per definitie zeer inefficiënt is om clonaliteit te bereiken. Aan de andere kant bleek onder deze omstandigheden dat meer dan 93% van de positieve labelingsgebeurtenissen klonaal was.
We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u individuele cellen van kiजembryo's injecteert bij het uitvoeren van deze procedure. Het is belangrijk om te onthouden dat u een grote hoeveelheid stock-plasmide moet verdunnen tot een ideale concentratie voor infecties van individuele cellen, om deze vervolgens gedurende uw experimenten te gebruiken. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het injecteren van plasmide-DNA in individuele cellen van kipsomieten of neurale buizen met behulp van micropipetten met een fijne punt. Het doel is om clonale populaties van getransfecteerde cellen te creëren die groen fluorescent proteïne tot expressie brengen.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genetische modificatie
Achtergrond
- Microinjectietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van genfuncties.
- Kippenembryo's worden veel gebruikt als modelorganisme.
- Plasmid-DNA kan worden gebruikt om fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen voor visualisatie.
- Transfectie van enkelvoudige cellen maakt de analyse van clonale celpopulaties mogelijk.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het injecteren van plasmide-DNA in specifieke weefsels.
- Het genereren van enkelvoudig getransfecteerde cellen voor verder onderzoek.
- Het faciliteren van de observatie van genexpressie in levende embryo's.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van microinjectiepijpetten met passende tipdiameters.
- Voorbereiding van plasmid-voorraadoplossingen voor injectie.
- Voorbereiding van kiजembryo's voor microinjectie.
- Injectie van plasmid-DNA in somieten of neurale buizen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle injectie van plasmide-DNA in doelweefsels.
- Generatie van enkelvoudige getransfecteerde cellen die zich ontwikkelen tot clonale populaties.
- Visualisatie van genexpressie via groen fluorescent eiwit.
- Vaststelling van een protocol voor toekomstige studies naar genfunctie.
Conclusies
- De micro-injectietechniek is effectief voor transfectie van enkelvoudige cellen.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse studies binnen de ontwikkelingsbiologie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om genfuncties in vivo te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Transfectie van enkelvoudige cellen in kiजembryo's maakt nauwkeurige lineage tracing en genetische manipulatie mogelijk, wat bijdraagt aan de validatie van targets in ontwikkelingspaden. Deze methode biedt mechanistische risicovermindering door het gedrag van progenitorcellen te koppelen aan fenotypische uitkomsten, wat vroege beslissingen in het ontdekkingsproces ondersteunt. De reproduceerbaarheid en kwantitatieve clonale analyse verhogen het voorspellende vertrouwen in preklinische modelsystemen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het volgen van clonale nakomelingen van enkele progenitorcellen in subdomeinen van het somiet en de neurale buis.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van afgeleide celtypen (bijv. dermis en spierweefsel) vanuit gelabelde precursoren.
- Strategische waarde: Faciliteert portfolio-triage door genetisch gemanipuleerde clonale populaties te vergelijken met controles voor een functionele beoordeling van targets.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows via sporadische transfectie van individuele cellen in gedefinieerde weefseldomeinen.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid door gecontroleerde plasmidconcentraties (0,05–0,1 µg/µl voor clonale labeling) en consistente micro-injectieparameters.
- Strategische waarde: Verbetert de screeningbereidheid door schaalbare, platformcompatibele lineage tracing mogelijk te maken over meerdere embryonale segmenten (6–12 per embryo).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door clonale dynamiek in vertebraten-embryogenese te modelleren, wat relevant is voor onderzoek naar aangeboren afwijkingen.
- Operationele waarde: Waarborgt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via immunohistochemie en seriële sectieanalyse van getransfecteerde segmenten.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang door clonale succespercentages te kwantificeren (~10% transfectie, >93% clonaliteit onder positieven) om de opschaling van experimenten te informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, variërend van hypothese-toetsing in de vroege biologie tot lead-identificatie via clonale functionele analyse, en preklinisch werk door middel van longitudinale fenotype-tracking.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door lineage tracing van enkelvoudige progenitorcellen mogelijk te maken, om zo de diversificatie van het lot in somiet- en neurale buislijnen te verhelderen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door reproduceerbare micropipetpreparatie (8–10 µm tipdiameter) en gestandaardiseerde DNA-laadprotocollen.
- Analyses: Levert kwantitatieve output via immunofluorescentiemicroscopie en doorsnedescaning om clonale expansie en de bijdrage van derivaten in de loop van de tijd te meten.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door vergelijking van gemanipuleerde clonale populaties met controles mogelijk te maken tot drie dagen na injectie.
- Herbruikbaarheid binnen de Organisatie: Functioneert als een herbruikbare capaciteit over verschillende studies heen dankzij gestandaardiseerde embryo-preparatie, pipetkalibratie en plasmiddilutieworkflows.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in lineage-relaties.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van single-cell transfectie over verschillende ontwikkelingsmomenten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door vroege clonale fenotypering.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen op basis van kwantitatieve metrics van clonale afgeleide.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste expertise in het trekken van micropipetten en het hanteren van embryo's om tipdiameters van 8–10 µm en een succesvolle weefselpenetratie te bereiken.
- Benodigde instrumentatie omvat een micromanipulator, een luchtdrukinjector en fluorescentiemicroscopie voor clonale tracking.
- Standaardisatie tussen teams vereist een consistente plasmidverdunning (bijv. 0,05–0,1 µg/µl) en embryo-stadiëringsprotocollen om reproduceerbare transfectiepercentages te waarborgen.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen omvatten het aanpassen van de injectiedruk en de DNA-concentratie op basis van de weefseltoegankelijkheid en de embryonale geometrie.
- Praktische beperkingen omvatten een lage transfectie-efficiëntie (~10%), waardoor verdunning van de stock en herhaalde injecties noodzakelijk zijn om een resolutie op single-cell niveau te bereiken.
