Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals de mechanismen van neuronale celmigratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u individuele en collectieve celmigratie op lange termijn detecteren. Na het isoleren van 200 milliliter bacteriële cultuur door de alkalische lyse methode, meng de twee plasmiden, zodanig dat de uiteindelijke concentratie van elk is vier microgram per microliter.

Broed de vruchtbare kippeneieren horizontaal bij 38 graden Celsius in 70% relatieve vochtigheid. Gebruik na twee en een halve dag een spuit van 20 milliliter met een naald van 18 meter om vijf milliliter albumine van de puntige kant van het ei te elimineren. Sluit het gat af met tape.

Gebruik vervolgens een gebogen schaar om de bovenkant van de eierschaal te snijden en een gat te openen, twee centimeter in diameter. Controleer onder een stereomicroscoop de ontwikkelingsfase van het embryo. Sluit dit grotere gat af met tape.

Zet de incubatie voort bij 38 graden Celsius en 70 procent relatieve vochtigheid tot E5,5. Bereid vóór elektroporatie 10 microliter van het genoemde plasmide DNA dat gekleurd is met 0,5 microliter snel groen. Ook bereiden 10 milliliter van autoclaved PBS met 100 eenheden per milliliter penicilline, en 100 microgram per milliliter streptomycine.

Gebruik een micropipet processor om micropipets gemaakt van glazen capillaire buizen voor te bereiden. Snijd de distale punt van de micropipet tot een geschikte poriegrootte voor de hoeveelheid DNA die moet worden geïnjecteerd. Gebruik een schaar om de verzegelde bovenste schelp te snijden om een gat te heropenen, twee en een halve centimeter in diameter, en zet het ei stabiel onder de stereomicroscoop.

Deponeren een paar druppels van de voorbereide PBS oplossing in het ei. Met behulp van twee fijne tangen, schil het allantoïsche membraan dat het embryo bedekt, wees voorzichtig om geen bloeding te veroorzaken. Verwijder vervolgens de amnion van het hoofd van het embryo.

Gebruik tijdens het draaien van de kop met een microspatula een micropipet die is aangesloten op een zuigbuis, om tussen 0,1 en één microliter van het gekleurde DNA in de ventriculaire holte van het linker optische tectum te injecteren. Plaats een paar tangen type elektroden rond het doelgebied van het optische tectum. Gebruik de pulsgenerator om een pre-puls van 30 volt op te laden voor een milliseconde met een interval van vijf milliseconden en voor latere pulsen van zes volt gedurende vijf milliseconden met een interval van 10 milliseconden.

Na dit alles, verzegel het gat met tape, en blijven broeden op 38 graden Celsius en 70 procent relatieve vochtigheid. Week de elektroden in een plastic schotel gevuld met PBS, en gebruik een interdentale borstel om de albumen te verwijderen. Herhaal het proces van de eerste schaal snijden aan de elektroporatie voor elk ei.

Een dag voor de Flat-Mount Cultuur, begon de voorbereiding van de gecodeerde cel cultuur Insert door het toevoegen van autoclave aan gedestilleerd water aan een 10 centimeter cel cultuur schotel. Float sommige cel cultuur Inserts op het water. Bij een oplossing met acht microgram per milliliter laminine en 80 microgram per milliliter Polly L, om de inserts te bedekken.

Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius in de celcultuur koolstofdioxide incubator. Op de dag van de cultuur op E7.0, verwijderde de laminine en poly l-lysine oplossing uit de Insert. Breng de Insert vervolgens over op een glazen bodemschaal gevuld met 1,1 milliliter kweekmedium.

Breng de schotel naar de celcultuur koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius. Zet een vochtige kamer eenheid op een omgekeerde confocale microscoop met een gasstroom van 40% zuurstof en 5% kooldioxide, en een temperatuur van 38 graden Celsius. Om te beginnen met het voorbereiden van een weefselmonster op de Insert, gebruik tangen om het embryohoofd uit te knijpen in een celkweekschotel van zes centimeter met ijskoude HBSS.

Gebruik twee fijne tangen om het geëlektreerde optische tectum te isoleren. En gebruik dan een plastic druppel om het over te brengen in een holle glazen schotel op basis van zwart silicium en gevuld met ijskoude HBSS. Controleer de positie van de etikettering onder fluorescerende stereoscopische microscoop.

Met behulp van een micro chirurgisch mes, knip het tectale weefsel rond de etikettering, terwijl de richting van het weefsel in het tectum. Gebruik hierna een plastic druppel om het gelabelde weefsel over te brengen naar de insert, zodat de pinzijde aan de insert is bevestigd. Leg het tectale weefsel in de gewenste richting en verwijder overtollige HBSS.

Herhaal het weefselpreparaat voor andere weefselmonsters die bestemd zijn voor dezelfde insert. Plaats vervolgens de schotel in de voorgevormde kamer van de omgekeerde confocale microscoop. Controleer met behulp van de omgekeerde confocale microscoop de fluorescerende etikettering en richt u op het microscopische veld.

Start de laser confocale eenheid. Monster de confocale scan om de richting en positie van het weefsel langs de x- en y-assen in het veld aan te passen. Selecteer vervolgens de scangrootte.

Bepaal het interval en het totale bereik van de confocale scan langs de z-as. Neem een interval van vijf of 10 micrometer voor het bereik van 100 micrometer. Kies het tijdsinterval van de confocale beeldvorming en de totale beeldtijd.

Na het instellen van de parameters van het confocale hardloopprogramma, begint u met beeldvorming. Zodra de beeldvorming is voltooid, combineerde u de confocale beelden op een andere C-as om z-stack-beelden te produceren met de uiteindelijke brandpuntsaanpassing op elk tijdstip. Voeg vervolgens de Z-stackafbeeldingen op verschillende tijdstippen toe om een time-lapse-film te maken.

In deze studie wordt celmigratie gedetecteerd in oppervlakkige lagen door elektroporatie in Ovo, flat mount celcultuur en time-lapse confocale beeldvorming. De tangentially migrerende cellen en de kernen in de oppervlakkige lagen van het optische tectum worden hier gezien nul uur, negen uur, 18 uur en 27 uur na het begin van de opname. Een time-lapse film van 10 minuten intervallen over een periode van 28 uur en 50 minuten, toont de massabeweging van migrerende cellen en hun kernen.

De samengevoegde film toont duidelijk de massabeweging van de migrerende cellen. De directionaliteit van de celmigratie kan worden onderzocht door zich te concentreren op de zich verspreidende cellen van het gelabelde centrum naar alle richtingen. De duidelijke beelden van de nucleaire beweging, zorgt voor de automatische tracking van de nucleaire migratie met behulp van een deeltjes tracking plugin.

Temporele veranderingen van de trajecten van de tangentiële migratie kunnen worden gevisualiseerd en bewijzen dat de verspreidende migratie omnidirectioneel is. Hogere vergrotingsbeelden kunnen in intervallen van vijf minuten worden gemaakt. Om individueel celgedrag te onderzoeken met de sequentiële morfologische verandering van het leidende proces, het trailingproces en de kernen.

Na deze procedure kan etikettering van verhelderende handelingen worden uitgevoerd. Om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de mechanismen van Aksum-begeleiding.