Het bepalen van het aantal cellen tijdens de celdeling Cultuur met de Scepter Cell Counter

De scepter cel teller is een handmatig geautomatiseerd apparaat voor het tellen van cellen, het monitoren van de cel diameter en het celvolume, en het controleren van de gezondheid en kwaliteit van cellulaire populaties. Het biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere telmethoden, waaronder een verbeterde nauwkeurigheid, gebruiksgemak en lage kosten voor het tellen van cellen. Volg bij het gebruik van de scepter de instructies op het grafische display om cellen in de wegwerpsensor op te zuigen.

De cellen worden vervolgens geteld en het apparaat rapporteert celconcentraties en statistieken, die naar een computer kunnen worden geüpload en geanalyseerd. Hallo, ik ben Sonya. Ik ben onderzoekswetenschapper hier bij Millport, en vandaag ga ik u laten zien hoe u de Scepter gebruikt.

Celsteller Het tellen van cellen is een noodzakelijke maar tijdrovende stap voor in vitro celkweek. Consistente celconcentraties waarborgen de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van experimenten. Celmetingen zijn belangrijk voor het monitoren van de celgezondheid en de proliferatiesnelheid, het beoordelen van immortaliserde of getransformeerde cellen voor daaropvolgende experimenten, transfectie of infectie, en de voorbereiding van celgebaseerde assays, waarbij snelheid en nauwkeurigheid essentieel zijn.

Bij het tellen van cellen telde 71% van de 400 ondervraagde onderzoekers de cellen met behulp van een hemocytometer. Hoewel hemocytometrie goedkoop is, is het arbeidsintensief en onderhevig aan gebruikersbias en onjuist gebruik, wat resulteert in onnauwkeurige tellingen. Bronnen van fouten bij hemocytometrie omvatten een ongelijkmatige celverdeling in het monster en te veel of te weinig cellen in het monster.

Subjectieve beslissingen over de vraag of een bepaalde cel binnen het gedefinieerde teltelgebied valt. Contaminatie van de hemocytometer, variatie tussen gebruikers en variatie in de vulsnelheid van de hemocytometer om de eentonigheid die gepaard gaat met handmatig tellen te verminderen. 29% van de onderzoekers telt cellen met behulp van geautomatiseerde celteeltoestellen.

Voor de meeste onderzoekers vormt de prijs van deze grote tafelapparatuur echter een barrière voor het gebruik ervan. De scepter celsteller is een geautomatiseerd handapparaat dat de automatisering en nauwkeurigheid van Coulter-tellingen biedt tegen relatief lage kosten in een gebruiksvriendelijk handformaat. Het systeem maakt gebruik van het Coulter-principe van impedantiegebaseerde partikeldetectie in een geminiaturiseerd formaat, waarbij een combinatie van analoge en digitale hardware wordt gebruikt voor signaalverwerking van de sensor, gegevensopslag en grafische weergave.

De wegwerpsensor is ontwikkeld met een micro-gefabriceerde celdetectiezone die discriminatie op basis van celgrootte en celvolume mogelijk maakt met een submicron- en subpicoliterresolutie, ondersteund door precisiekanalen voor vloeistofbehandeling en elektronica. De Scepter-celteller geeft celpopulatiestatistieken grafisch weer als een histogram voor gebruik. De Scepter-celteller begint met het verdunnen van een suspensie van enkelvoudige cellen in fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Een concentratie van 10.000 tot 500.000 cellen per milliliter is optimaal. Breng 100 microliter van de verdunde cellen over naar een microview-buisje van 1,5 milliliter. Zet de scepter celsteller aan door de schakelaar aan de achterzijde van het instrument ingedrukt te houden en wacht tot de instructies op het scherm verschijnen.

Bevestig, wanneer u hiertoe wordt aangemoedigd, een sensor aan het uiteinde van de scepter-unit, waarbij het elektrodesensingpaneel naar de voorkant van het instrument is gericht. Scepter-sensoren bestaan uit een precisie-gevormde bemonsteringskamer met een elektronische sensingzone en geïntegreerde celsensing-elektroden. De sensoren maken het mogelijk om celgrootte met submicronresolutie en celvolume met sub-picoliterresolutie te onderscheiden.

Consistente sensor engineering garandeert dat gelijke volumina monsters worden geteld en dat nauwkeurige groottemetingen worden uitgevoerd. Zodra de sensor is bevestigd, voert u elke stap van het telproces uit volgens de instructies op het scherm als volgt. Wanneer op het scherm staat 'houd de zuiger ingedrukt om te beginnen', drukt u op de zuiger; het scherm zal vervolgens aangeven 'dompel de sensor onder', waarna u de sensor in de celsuspensieoplossing dompelt, en laat u de zuiger los om de celsuspensie in de sensor te aspireren.

De zuiger fungeert als een elektrisch signaal en zal het monster plus het dode volume in de sensor trekken. De snelheid of nauwkeurigheid van het indrukken is niet van belang, in tegenstelling tot bij het pipetteren. Dit proces zal enkele seconden duren wanneer het gereed is.

Het instrument geeft een pieptoon en op het scherm verschijnt de melding datHet monster is geladen. Zodra het monster in de sensor is geladen, wordt het door de detectiezone getrokken om de celgrootte en het celvolume te bepalen. Vervolgens stroomt het door de microkanalen; zodra 50 µL van het monster is geteld, geeft de sensor het instrument het signaal om te stoppen met tellen.

Zodra de telling is voltooid, verschijnt op het scherm van het instrument de melding count complete. Verwijder de sensor en gooi deze weg. Volg de aanwijzingen op het scherm om de sensor te verwijderen en weg te gooien.

Het instrument toont vervolgens op het scherm een histogram van de celgrootte of diameter, evenals de celconcentratie per milliliter. Nadat de telling is voltooid en het histogram op het instrument wordt weergegeven, kunnen gates worden toegepast door op de schakelknop te drukken; selecteer 'auto gating' om de gate automatisch in te stellen op basis van het histogramprofiel, of selecteer 'use last' om de gates van de vorige telling te gebruiken. Ongeacht de selectie kunnen de gates handmatig worden verplaatst voor een nauwkeurige afstelling.

Stel de gegevens af, druk opnieuw op de schakelknop om de linkerpoort te selecteren en schuif met de schakelknop om de poort naar de gewenste positie te verplaatsen. Druk vervolgens opnieuw op de schakelknop om de rechterpoort te activeren en schuif met de schakelknop om de rechterpoort te plaatsen. Klik nogmaals.

Een nieuwe celconcentratie, het gemiddelde celvolume en de diameter worden weergegeven. De schakelaar kan naar beide zijden worden bewogen om het display te wisselen tussen datum/tijd, gemiddelde celgrootte en gemiddeld celvolume; tot 72 histogrammen kunnen op het instrument zelf worden opgeslagen. Om de gegevens naar een persoonlijke computer te uploaden, sluit u het instrument aan via de USB-kabelpoort, op het beeldscherm van de pc.

Dubbelklik op de Scepter-softwareapplicatie om de software te starten. Klik vervolgens op verbinden. Alle tellingen worden automatisch naar de software overgedragen.

De scepter-applicatiesoftware toont het histogram met de populatieverdeling van de cultuur, uitgedrukt in volume of diameter. De gedownloade bestanden kunnen vervolgens worden geëxporteerd naar Microsoft Excel, waar de ruwe gegevens worden weergegeven in intervallen van gespecificeerde celdiameters of celvolumes. Er werden 19 verschillende cellijnen klaargemaakt voor telling en de theoretische startconcentraties werden bepaald met een celteller.

Deze cel-suspensies werden vervolgens verder verdund om cel-suspensies met theoretische celconcentraties te verkrijgen. De scepter celcounter werd vervolgens gebruikt om de celconcentraties te bepalen. Deze figuur toont vijf verdunningen die zijn gemeten voor vijf representatieve cellijnen, samen met de theoretische celconcentratie.

De hoge mate van lineariteit, zoals aangegeven door de r-kwadraatwaarden, laat zien dat scepter-telling een betrouwbare methode is voor de geteste cellijnen over een breed lineair werkbereik. De algemene relatieve nauwkeurigheid van scepter-telling wordt hier aangetoond door gegevens verkregen via scepter-telling te vergelijken met tellingen verkregen via coter-telling. De logaritme van de scepter-celtellingen is uitgezet tegen de logaritme van de coter-tellingen, waaruit blijkt dat scepter-tellingen voor alle geteste cellijnen overeenkomen met coter-tellingen.

Tellingen van 19 cellijnen werden uitgevoerd met een Z two coulter counter. De scepter cell counter, een geautomatiseerde visiegebaseerde teller, zoals het V cell- of count test-systeem, en hemo TER tellingen werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, waarbij dezelfde initiële celsuspensie en identieke verdunningen werden gebruikt. De in deze figuur getoonde resultaten laten zien dat de met de scepter-telmethode gemeten celconcentraties nauw overeenkomen met de theoretische celconcentraties met een hoge lineariteit.

Het procentuele variatiecoëfficiënt of CV werd berekend voor elke verdunning van elke cellijn. Voor elk telfysteem worden hier de gemiddelde procentuele CV's weergegeven over 19 cellijnen met betrekking tot de celconcentratie en de telmethode binnen het werkbereik. De Scepter cellenteller is preciezer dan tellen met een hemocytometer, met kleinere standaarddeviaties en kleinere gemiddelde variatiecoëfficiënten.

Scepter-telling is 10 keer sneller dan hemocytometrie en ook sneller dan andere automatische tellers. Hier werden SF nine, MCF seven en HC 2 93 cellen geteld met de in deze video beschreven methoden. De gemiddelde tijd die nodig was om de celconcentratie te meten, is vastgelegd.

Let op dat de hemocytometrie slechts één keer per monster is uitgevoerd. Scepter voert metingen uit op basis van de celgrootte. Hierdoor kunnen eventuele veranderingen in de cellulaire morfologie in het histogram worden vastgelegd.

Gezonde culturen vertonen een mooie klokvormige Gaussische distributie, terwijl ongezonde cellen afsterven en een verschuiving in het histogram naar links veroorzaken. Op dezelfde manier werden verschuivingen in het histogram waargenomen wanneer een populatie van 50% dode cellen werd gemengd met 50% levende cellen. Ik heb u zojuist laten zien hoe u de nieuwe Scepter cell counter van Millipore gebruikt, die de manier waarop onderzoekers hun cellen tellen revolutioneert.