Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Het algemene doel van deze procedure is om de structurele DNA-intermediairen die ontstaan wanneer replicatie DNA-laesies tegenkomt, te visualiseren met behulp van tweedimensionale gelanalyse. Dit wordt bereikt door eerst het DNA te isoleren uit actief delende cellen waarin replicatieblokkerende laesies zijn geïnduceerd. Vervolgens wordt gelelektroforese gebruikt om het teruggewonnen DNA op basis van grootte te scheiden.

Vervolgens worden de banen uitgesneden en horizontaal opnieuw gegoten in een tweede gel, die het DNA verder scheidt op basis van zowel grootte als vorm. Ten slotte wordt Southern-analyse gebruikt om de DNA-structuren te visualiseren die geassocieerd zijn met replicerende DNA-fragmenten vóór en op verschillende tijdstippen na de introductie van UV-geïnduceerde schade. Uiteindelijk kan deze procedure worden gebruikt om aan te tonen dat het onvermogen om DNA-laesies te verwerken bij bepaalde mutanten resulteert in de accumulatie van DNA-reparatie-intermediairen.

Hoi, mijn naam is Arthur Ian. Ik kom van het Corella Lab aan de Portland State University. Hoi, mijn naam is Brand she, ik kom ook van het Corella Lab.

Vandaag tonen we u een procedure voor tweidimensionale gelelektroforese. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om DNA-replicatie- en reparatie-intermediairen te bestuderen. Laten we beginnen.

Om deze procedure te starten, wordt een overnight-cultuur van 200 µL e coli gekweekt die het plasmide PBR 3 22 bevat in DGC thigh-medium met ampicilline bij 37 °C. Het gebruik van DGC thigh-medium minimaliseert UV-afscherming. Na de overnight-incubatie worden de cellen gepellet bij 14.000 RRP M gedurende 30 seconden.

Resuspendeer vervolgens het celpellet in 200 µL DG C th-medium zonder ampicilline en inoculeer. Kweek culturen in 20 mL DG C thigh-medium zonder ampicillineselectie in een schudincubator bij 37 °C tot een OD 600 van 0,5, wat overeenkomt met ongeveer 5 × 10⁸ cellen per milliliter. Groei zonder ampicilline voorkomt selectie tegen abnormale of niet-productieve replicatie-intermediairen die in sommige mutanten kunnen voorkomen.

Bovendien is het, indien UV-licht wordt gebruikt om schade op te wekken, noodzakelijk om de ampicilline uit het medium te verwijderen, omdat deze sterk absorbeert bij deze golflengten en zo een afscherming vormt. De cellen verminderen de effectieve dosis UV terwijl de cellen groeien. Gebruik een UVC-fotometer om de afstand tot een germicide lamp van 15 watt te bepalen die een blootstellingssnelheid van ongeveer één J/m² per seconde produceert.

De volgende stappen moeten onder geel licht worden uitgevoerd om te voorkomen dat fotolyase de fotoreactivatie-omkering van cyclobutaan-pyrimideendimeren na UV-bestraling veroorzaakt. Zodra de gewenste celdichtheid is bereikt, wordt de cultuur met een pipet overgebracht naar een Petrischaal met een diameter van 15 centimeter op een draaiplateau om een gelijkmatige bestraling van de gehele celpopulatie te garanderen. Bestraal de culturen vervolgens met 50 joules per meter squared en breng ze onmiddellijk over in een steriele, voorverwarmde kolf en plaats deze terug in de schudincubator bij 37 degrees Celsius.

Gedurende de experimentduur produceert deze dosis gemiddeld één cyclobutaan-pyrimidine-dimeer per 4,5 kilobasen enkelstrengs DNA voor elk tijdstip dat onderzocht moet worden. Pipetteer een aliquot van 0,75 milliliter van de cultuur in 0,75 milliliter ijskoud net 30-buffer. Net 30-buffer dient als stopbuffer die voorkomt dat replicatie en nucleotide-excisie-herstel plaatsvinden.

Zodra de stopbuffer is toegevoegd, kan het monster op ijs bewaard worden tot het einde van de tijdreeks. Pelleteer na de tijdreeks elk monster en resuspendeer de pellets. Lyseer de cellen in 150 µL lysisbuffer gedurende 20 minuten bij 37 °C zonder agitatie.

Omdat replicerende structuren met enkelstrengs regio's of vertakkingspunten vatbaarder zijn voor afschuiving, kunnen pipetpunten met een scheermesje worden afgeknipt om de opening te verbreden en afschuifkrachten te minimaliseren. In het algemeen moet pipetteren en agitatie tot een minimum worden beperkt totdat het DNA is gedigesteerd met restrictie-enzymen; voeg na lysis proteinase K en sarcas cell toe en laat de incubatie nog een uur voortduren. Dit dient om DNA-fragmenten die geassocieerd zijn met eiwit vrij te maken.

Aangezien actief replicerend DNA vaak gebonden is aan eiwit- of membraancomplexen, helpt dit de opbrengst van replicatiefragmenten te verhogen. Extraheer na één uur de monsters door twee volumes fenol aan elk monster toe te voegen en de buisjes gedurende vijf minuten voorzichtig te keren. Voeg vervolgens twee volumes chloroform-isoamylalcohol toe en keer de buisjes nogmaals vijf minuten voorzichtig.

Centrifugeer de monsters vervolgens gedurende vijf minuten bij 14, 000 RPM in een microcentrifuge en breng de bovenste waterige fase van elk monster over in een nieuw buisje. Voeg daarna vier volumes chloroform-isoalcohol toe en keer de buisjes opnieuw gedurende vijf minuten voorzichtig om. Centrifugeer de monsters opnieuw vijf minuten bij 14, 000 RPM.

Plaats een dialysemembraan bovenop 250 milliliters van 0,1 xte in een bekerglas en breng 100 microliters van elk monster aan op het membraan. Laat de monsters één uur dialyseren. Breng 80 microliters van elk monster over in een schone 1,5 milliliter buis die 20 microliters enzymmix bevat.

Verteer de monsters een nacht lang bij 37 °C. PV two lineariseert het plasmide net stroomafwaarts van de replicatie-oorsprong. Voeg vóór het laden van de agarosegel 100 µL chloroform en 20 µL zes x laadkleurstof met broom toe.

Voeg fenolblauw en xyleen-cyaan toe aan elk monster en meng; chloroform verwijdert alle resterende PV2 die aan de DNA-uiteinden is gebonden. Begin de tweedimensionale agarosegelanalyse door de restrictie-digestere DNA-monsters door de eerste dimensie te laten lopen. Laad eerst een Lambda HindIII-sizemarker in de eerste baan van een vooraf bereide 0,4% agarosegel in 1x TBE.

Laad vervolgens 40 µL van de waterige fase met de laadkleurstof voor elk monster, waarbij lanes worden overgeslagen om het snijden van de gel te vergemakkelijken. Voer na de elektroforese de eerste dimensie uit bij één volt per centimeter gedurende ongeveer 12 tot 15 uur. De lage spanning en het lage percentage AGROS-gel dienen om de DNA-fragmenten primair op basis van grootte te scheiden.

Nadat de eerste dimensie is voltooid, gebruikt u een groot slagmes om de eerste baan die de Lambda Hind III-marker bevat uit te snijden en kleurt u deze met ethidiumbromide. Snijd voor de tweede dimensie de gelbanen uit met het grote slagmes, waarbij u de Lambda Hind III-marker als richtlijn gebruikt; snijd het gebied onder de verwachte positie van het gelineariseerde plasmide in elke baan weg en gooi dit weg. Om de tweede dimensie te gieten, plaatst u elke strip horizontaal bovenop een lege gelvorm.

Bereid een oplossing van 1%AROS in één XTBE voor en koel deze af tot 55 °C. Giet de geloplossing na het afkoelen om de tweede dimensie te gieten, waarbij u ervoor zorgt dat de gelplakjes volledig bedekt zijn. Het is belangrijk om te controleren of de plakjes gelijkmatig georiënteerd zijn en of de gietvorm waterpas staat voordat de gel wordt gegoten.

Zodra de gel is gestold, wordt de tweede dimensie uitgevoerd gedurende vijf en een halve tot zeven uur bij 6,5 V per centimeter in een elektroforesee-unit die recirculatie van de buffer mogelijk maakt; de hoge spanning en het hoge percentage Agros-gel scheiden de DNA-fragmenten effectief op basis van zowel hun vorm als hun grootte. Niet-lineaire vormen migreren langzamer door de tweede dimensie na de elektroforese. Spoel de gel eenmaal met water en was deze vervolgens twee keer gedurende 15 minuten met zachte agitatie in 400 milliliter 0,25 molair zoutzuur.

De zuurwassingen dienen om de DNA-moleculen gedeeltelijk in kleinere fragmenten te knippen die efficiënter overdragen tijdens de Southern-analyse; dit is noodzakelijk vanwege de grote omvang en de ongebruikelijke vorm van de DNA-replicatie-intermediairen. Om de gel voor alkalische overdracht voor te bereiden, spoelt u de gel opnieuw af met water en wast u deze vervolgens twee keer gedurende 30 minuten in 400 milliliters 0,4 molar natriumhydroxide. Het DNA in de gels wordt vervolgens overgebracht naar een high bond n plus nylonmembraan met behulp van een neerwaartse alkalische overdrachtssysteem met 0,4 molar natriumhydroxide, zoals beschreven in het geschreven gedeelte van deze procedure. Laat het DNA zes tot 12 uur overdragen; ga na de DNA-overdracht verder met de probe-hybridisatie zoals uiteengezet in het geschreven protocol.

Zodra het membraan is geprobeerd en gewassen, wordt het membraan op een papieren handdoek geplaatst totdat de vloeistof zichtbaar is verdwenen. Wikkel het membraan vervolgens in polyvinylchloride-plasticfolie en stel het bloot aan een fosfor-imager-scherm. Ten slotte kan de radioactiviteit worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van een storm eight 40 en de bijbehorende image quant.

Het migratiepatroon van PV twee gedigesteerd PBR 3 22 plasmide, waargenomen via 2D agarosegelanalyse, is in het schema weergegeven. Niet-replicerende lineaire plasmiden migreren als lineaire 4.4 KB fragmenten; replicerende plasmidevormen vormen Y-vormige structuren die langzamer migreren dan de niet-replicerende fragmenten vanwege hun grotere omvang en niet-lineaire vorm. Dit migratiepatroon vormt een boog die na UV-bestraling vanuit het lineaire gebied richting de put uitstrekt.

Dubbele Y- of X-vormige moleculen worden waargenomen in het conusgebied en migreren langzamer dan de boog van Y-vormige moleculen. Een voorbeeld van de zuidelijke analyse van de 2D-gel, gesonde met P 32-gelabeld PBR 3 22, wordt getoond voor cellen direct na UV-bestraling en 15 minuten na UV-bestraling direct na UV-bestraling. Ongeveer 1% van het totale plasma-DNA kan worden aangetroffen in de Y-boog wanneer cellen zich in een snelle exponentiële groeifase bevinden na bestraling.

Een tijdelijke toename van Y-vormige moleculen wordt waargenomen wanneer geblokkeerde replicatievorken zich ophopen bij beschadigde sites. De L-vormige replicatie-intermediaten hopen zich ook tijdelijk op en blijven aanwezig tot een tijdstip dat correleert met het moment waarop de laesies worden hersteld. We hebben zojuist laten zien hoe DNA-reparatie-intermediaten gevisualiseerd kunnen worden met behulp van tweedimensionale gelelektroforese.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met schuifkrachten die de opbrengst kunnen verminderen; wees daarom voorzichtig met alle monsters en gels. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.