In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is het bepalen van stoichiometrische en structurele informatie over proteïnen. Alle ligamentcomplexen die levende biologische cellen tot expressie brengen, gistcellen, zijn genetisch gemodificeerd om de proteïnen van belang tot expressie te brengen, gehecht aan een donor- of een acceptor-fluorescente probe. Donorprobes kunnen direct door een laser worden geëxciteerd.

Terwijl acceptoren alleen kunnen worden geëxciteerd door een energieoverdracht van een nabijgelegen geëxciteerde donor, worden de cellen blootgesteld aan licht van een gepulseerde nabij-infraroodlaser. De fluorescentie die uit de probes komt, wordt door een transmissierooster gescheiden in spectrale componenten en geprojecteerd op het oppervlak van een elektronen-vermenigvuldigende CCD-array. Hierdoor worden volledige fluorescentiespectra van individuele ligamenten verkregen voor elke positie in het monster.

Het spectrale profiel van de gedetecteerde fluorescentie is afhankelijk van de specifieke interactie van de eiwitten van belang. De gegevens worden geanalyseerd om voor elke beeldpixel van een scan-cel de afzonderlijke emissies van de donor- en acceptor-probes te bepalen. De efficiëntie van de energieoverdracht wordt voor elke beeldpixel bepaald, waarna de pixels worden gegroepeerd op basis van hun FRET-efficiëntie en histogram.

De interpretatie van het histogram maakt de in vivo bepaling van de grootte en configuratie van eiwitten en complexen mogelijk. Hallo, mijn naam is Michael Stoneman van de Riku Research Group aan de Universiteit van Wisconsin Milwaukee. Mijn naam is Singh.

Ik kom van het Rikus Lab in Milwaukee, Wisconsin. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de volledige emissieprofielen van honderden ligamentcomplexen binnen een cel worden verkregen met één volledige scan van de cel. Meestal vereisen de meeste fluorescentiemicroscopiemethoden dat de betreffende cel meerdere keren wordt gescand om voldoende spectrale informatie te verzamelen om de FRET-efficiëntie in verschillende regio's van belang binnen de cel te bepalen.

Diffusie-biochemische reacties kunnen echter de moleculaire samenstelling van deze regio's van belang veranderen en daarmee de informatie die uit de scan van het beeld wordt verkregen, beperken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij de studie van eiwitten en eiwitinteracties in levende cellen, zoals: wat is de grootte van de schadelijke oligomeren? In welke fase van de levenscyclus van het eiwit worden de oligomeren gevormd, en wat is de rol van oligomeren van dit eiwit in de cellulaire functie?

De spectraal opgeloste twee-fotonenmicroscoop verzamelt spectrale informatie over de oligomeercomplexen in de beeldcel door de focus van de excitatiestralen op een reeks locaties over het betreffende monster te scannen. Een paar orthogonale scanspiegels wordt gebruikt om de focus van de laserstraal in twee verschillende richtingen over het monster te verplaatsen. De beweging van de scanspiegels wordt computergestuurd en gesynchroniseerd met de extractie van fluorescentie-intensiteitsgegevens van de CCD-camera; uit de lijnscans kunnen ruimtelijke kaarten van de fluorescentie-intensiteit worden gereconstrueerd die overeenkomen met een specifieke golflengte van het licht.

Om ruimtelijke x-ray fluorescentie-intensiteitskaarten nauwkeurig te reconstrueren en de werkelijke golflengte te berekenen die correspondeert met elk van deze kaarten, moet het line-scanning protocol worden gekalibreerd met behulp van een fluoresceïne-oplossing. Om de kalibratieprocedure te starten, moet het excitatispectrum worden ingesteld op een golflengte van 800 nanometer, wat twee keer de maximale excitatiegolflengte is van de donor-tag GFP 22. Om het excitatispectrum in te stellen, dient het prisma in de laserholte te worden verschoven om de groepsnelheidsdispersie aan te passen via het computerprogramma waarmee de camera is gekoppeld. Stuur een commando naar de CCD-chip om de temperatuur van de CCD-chip te verlagen tot de laagst haalbare temperatuur.

Om de donkerruis te verminderen, pipetteer 10 µL fluoresceïne-oplossing op een objectglas en dek dit af met een dekglas, zodat een dunne laag van het monster gelijkmatig wordt verdeeld in de ruimte tussen het dekglas en het objectglas. Plaats vervolgens een kleine druppel immersie-olie op het oppervlak van het dekglas. Bevestig nu het objectglas aan de XY, Z-translatieondersteuning en verschuif het objectglas en de ondersteuning in de richting van de optische as. Verplaats het objectglas door de lineaire actuator handmatig bij te stellen totdat het objectief van de microscoop in contact komt met de druppel immersie-olie. Zet de camera in de videomodus voor gegevensverwerving, zodat het binnenvallende licht dat op de CCD-array valt in realtime op het computerscherm wordt weergegeven.

Schakel alle omgevingsverlichting in de kamer uit om de achtergrondruis die door het CCD-array wordt gedetecteerd te verminderen. Pas langzaam de micrometer aan die de translatietabel in de richting van de optische as regelt, om het monster in het brandpunt van de laserstraal te brengen. Wanneer het fluoresceïne-monster scherp is gesteld, zal de emissie als een scherpe lijn op het CCD-array verschijnen.

Download de uitlezing van de pixelintensiteiten van de CCD-array naar de computer. Meet de pixelintensiteit als functie van de positie op de CCD-array door de gedownloade matrix van intensiteitswaarden te openen in ImageJ en een lijn door het fluorescerende gebied te trekken. Gebruik het commando 'image day'.

Analyseer het plotprofiel om een grafiek te maken die het emissiespectrum van het fluoresceïnemonster illustreert. Pas de incrementele parameter van de spiegel aan, waarmee de beweging van de laser wordt aangestuurd. Focus in de Y-richting, zodanig dat aangrenzende y-posities binnen het monster leiden tot een verschuiving van de piek van de fluorescentiespectra met precies één pixel langs de spectrale dimensie op de CCD-array.

Om dit te monitoren, downloadt u de fluorescentiespectra-intensiteit voor twee verschillende Y-posities in het monster. Open vervolgens de intensiteitsafbeeldingen met ImageJ en bepaal de positie van de piekpixel voor elk van de fluorescentiespectra. Scan met de ImageJ-cursor, terwijl de sluiter van de CCD open blijft, de laserfocus over het monster in de X-richting.

Het licht dat door elke voxel langs de scanlijn wordt uitgezonden, moet op de CCD-array aan het einde van elke lijnenscan vallen; sla de gegevens van de CCD-array die voor deze lijnenscan zijn verkregen op en wis vervolgens de pixels van de CCD-array. Verplaats de positie van de laser. Focus in de Y-richting met de eerder bepaalde hoeveelheid.

Scan vervolgens de laserstraal in de X-richting over het monster. Sla de gegevens opnieuw op terwijl het sluiter van de CCD open blijft. Herhaal deze procedure voor het scannen van lijnen totdat een fysiek gebied dat ongeveer 50% groter is dan de afmetingen van een enkele biologische cel door laserlicht is verlicht.

De relatie tussen het rijnummer van een specifiek line-scanbeeld en de golflengte moet worden gebruikt om de beelden te reconstrueren, zodat meerdere fluorescentie-intensiteitskaarten van het gezicht bij verschillende golflengten kunnen worden verkregen. Om het fluorescentie-emissiebeeld voor een specifieke golflengte te verkrijgen, moet het rijnummer op het beeld van de eerste line-scan worden gevonden dat overeenkomt met deze golflengte. De aangrenzende rij van het daaropvolgende line-scanbeeld komt vervolgens overeen met de volgende rij van het fluorescentie-emissiebeeld.

Stapel voor die specifieke golflengte alle beeldrijen die bij deze golflengte horen om de XY-fluorescentie-intensiteitskaarten van het monster bij die golflengte te verkrijgen. Herhaal deze procedure voor alle overige verkrijgbare golflengten om gegevens van uw monsters te verzamelen. Haal eerst de platen met getransformeerde gistkolonies uit de incubator.

Er zouden ten minste drie typen getransformeerde cellen moeten zijn. Cellen die de eiwitten van belang tot expressie brengen, gelabeld met beide typen fluorescente probes. Cellen die alleen eiwitten tot expressie brengen die gelabeld zijn met de donor-fluorescente probes en cellen die alleen eiwitten tot expressie brengen die gelabeld zijn met de acceptor-fluorescente probes.

Voeg 100 µL 100 mM kaliumchloride toe aan een microcentrifugebuisje. Schraap vervolgens met de tip van een micropipet drie tot vijf gistkolonies van de plaat met cellen die eiwitten tot expressie brengen die getagd zijn met zowel donor- als acceptor-fluorescente probes en inoculeer deze in het 100 mM kaliumchloride. Neem van deze cellen 10 µL van de celsuspensie en breng dit aan op een nieuw microscoopglasplaatje.

Dek de druppel af met een dekglasplaatje en plaats een druppel olie op het oppervlak van het dekglasplaatje. Sluit vervolgens handmatig de sluiter in het pad van de laserstraal om te voorkomen dat het laserlicht het microscoopobjectief bereikt. Bevestig het microscoopOBJECTglas aan de XY, Z-translatietafel en verschuif de objecttafel in de richting van de optische as totdat het microscoopobjectief in contact komt met de druppel immersie-olie.

Zet nu de breedveldverlichting aan en ga naar de camera. Selecteer de videomodus voor gegevensverzameling. Het breedveldbeeld van het monster zal sterk vervaagd zijn vanwege de aanwezigheid van het transmissierooster in het emissiepad.

Plaats daarom een banddoorlaatfilter met een kleine volledige breedte op halve hoogte in het optische pad vóór het transmissierooster. Verplaats de translatietafel langzaam in de richting van de optische as terwijl u het beeld van de cellen op het camerascherm bekijkt, totdat de cellen scherp zijn gesteld. Verplaats de tafel in de X- of Y-richting om een enkele cel in de brandpuntsafstand van de laserstraal te brengen.

Schakel de widefield-lichtbron uit en verwijder het banddoorlaatfilter uit het emissiepad. Ontblokkeer de laserstraal kortstondig terwijl u gelijktijdig het signaal bekijkt dat door de CCD-array wordt ontvangen. Als er een fluorescentiesignaal op de CCD-array wordt gedetecteerd gedurende de tijd dat de laserstraal op de cel valt, voer dan een volledige scan uit voor de acquisitie van fluorescentiegegevens van deze cel.

Het is essentieel om dezelfde scanparameters te gebruiken, specifiek het aantal lijnen en de y-increment zoals bepaald in de eerder gedemonstreerde kalibratieprocedure. Herhaal het proces voor cel-locatie en fluorescentiedata-acquisitie voor een groot aantal cellen die eiwitten tot expressie brengen die aan zowel donor- als acceptortags zijn gekoppeld. Nadat er voldoende fluorescentiebeelden zijn verzameld van cellen die eiwitten tot expressie brengen die met beide receptoren zijn gelabeld, dient het gehele proces te worden herhaald voor zowel cellen die alleen eiwitten tot expressie brengen die zijn gelabeld met donorfluorescente probes als cellen die alleen eiwitten tot expressie brengen die zijn gelabeld met acceptorfluorescente probes.

Reconstrueer ten slotte alle scans om spectraal opgeloste XY-fluorescentie-intensiteitskaarten voor elke dataset te verkrijgen met behulp van de eerder beschreven procedure. In deze drie figuren zijn de resulterende ruimtelijke kaarten weergegeven, berekend uit spectraal opgeloste tweefotonmicroscopie-metingen uitgevoerd op een gistcel die de steriele alfa-factorreceptor tot expressie brengt. Tweedimensionale kaarten van donor- en acceptorsignalen werden verkregen door de spectrale emissieprofielen te analyseren die op elke locatie van de cel waren gemeten.

Aan de fluorescentie-intensiteiten worden valse kleuren toegekend op basis van hun waarden, en de schaal wordt als inzet getoond. Vervolgens is een tweedimensionale kaart van de schijnbare FRET-efficiënties berekend met behulp van de KDA- en KAD-beelden, gebruikmakend van de waarden die zijn geëxtraheerd uit de zojuist getoonde kaart van de schijnbare FRET-efficiënties van de cel, waarna een histogram is opgesteld. De gemeten EAPP-waarden van de cel worden weergegeven door cirkels.

De rode ononderbroken lijn vertegenwoordigt de beste fit van de gemeten gegevens met behulp van de som van de individuele calciumfuncties, weergegeven door ononderbroken groene lijnen. Analyse van het histogram, zoals beschreven in de protocoltekst, bevestigt dat het steriele two alpha factor receptor all ligament complex in vivo de vorm aanneemt van een RBA-vormig tetrameer. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 12 uur worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om het vermogen van de excitatiebron laag te houden. Het is essentieel om meervoudige excitatie van de donor door een enkele puls te vermijden.