Het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene C. elegans Model

Het algemene doel van het volgende experiment is om de toxiciteit van het bèta-amyloïde peptide te analyseren in een in vivo modelsysteem. De reproduceerbaarheid en relatieve eenvoud van deze assay maken het mogelijk om snel geneesmiddelen, omgevingsfactoren of genetische modificaties te testen op de toxiciteit van bèta-amyloïde. Een sleutelfactor bij de ontwikkeling van deze assay is de generatie van transgene cl egan's wormen met spierspecifieke, temperatuur-induceerbare expressie van het bèta-amyloïde peptide.

Deze temperatuursensitieve expressie is ontwikkeld door een transgen te construeren dat een abnormaal lange 3'-onvertaalde regio bevat, waardoor het transgen-mRNA een doelwit wordt van de mRNA-surveillance. De expressie van dit transgen is daarom gering in wild-type wormen met een functioneel mRNA-surveillance-systeem vanwege de degradatie van het transgen-mRNA. Indien dit transgen wordt geïntroduceerd in een genetische achtergrond die een mutatie bevat in een essentieel onderdeel van het mRNA-surveillance-systeem, zal de expressie van het transgen significant hoger zijn. Indien de genetische achtergrond een temperatuursensitieve mutatie in het mRNA-surveillance-systeem bevat, zal vermeerdering van deze transgene stam bij de niet-permissieve temperatuur de degradatie van het transgen-mRNA blokkeren en resulteren in een hoge expressie van het transgen. Transgene wormen die dit systeem gebruiken om de expressie van het bèta-amyloïde peptide in de spieren van de lichaamswand te reguleren, vertonen bij een temperatuurovergang van 16 °C naar 25 °C een hoge accumulatie van het bèta-amyloïde peptide, dysfunctie van spiercellen en verlamming van de wormen; de tijd hiervan wordt gemeten.

Het duurt een tijd voordat een populatie van deze transgene wormen verlamd raakt na een temperatuurstijging. Deze methode is een gevoelige assay voor bèta-amyloïde toxiciteit. Dit wordt bereikt door verse nematode-groeimediaplaten te maken voor de verlammingsassay, wat helpt om omgevingsvariabelen die de verlammingspercentages kunnen beïnvloeden te minimaliseren.

Als tweede stap worden leeftijdgesynchroniseerde populaties van transgene wormen geïnitieerd; dit minimaliseert de effecten van het ontwikkelingsstadium op de expressie van het transgen. Vervolgens worden gesynchroniseerde wormen in het derde larvale stadium overgezet van 16 °C naar 25 °C, wat de stabiliteit van het transgene mRNA verhoogt en leidt tot de accumulatie van het bèta-amyloïdpeptide. Door de tijd van de temperatuurverhoging tot aan verlamming voor elke worm te meten, wordt de snelheid van spierdisfunctie vastgelegd, waardoor de toxische effecten van de accumulatie van het bèta-amyloïdpeptide worden bepaald. De resultaten tonen het effect van specifieke behandelingen op de toxiciteit van endogeen tot expressie gebracht beta-amyloïdpeptide.

Het belangrijkste voordeel van onze techniek, in tegenstelling tot het gebruik van transgene muismodellen om de drugactiviteit te analyseren, is dat we onze methode veel sneller en veel goedkoper kunnen uitvoeren. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel. Het scoren van L4-wormen in een verlammingsassay is zeer moeilijk aan te leren.

Wanneer u een verlamde L4-worm scoort, moet u letten op de geïsoleerde halo-beweging van de kopregio van de worm. Zodra deze regio beweegt terwijl het gehele lichaam van de worm verlamd is, scoren we die worm als verlamd. Paralyse-assays worden uitgevoerd op platen met standaard nematode growth media of NGM, die routinematig worden gebruikt voor de propagatie en genetica van C. elegans.

Om de platen voor te bereiden, autoclaveert u de NGM-oplossing die natriumchloride, agar en peptide bevat in een erlenmeyer, en voegt u vervolgens de juiste hoeveelheden van de volgende steriele oplossingen toe die in het bijbehorende geschreven protocol te vinden zijn. Verdeel 10 milliliters vloeibaar NGM over elke Petri schaal van 60 millimeter bij 15 millimeter. Laat het NGM gedurende de nacht stollen bij kamertemperatuur.

Bij het testen van de effecten van verbindingen of extracten, verdeelt u het extract in aliquoten over elke plaat en gebruikt u een spreider om het gelijkmatig over het oppervlak van de plaat te verspreiden. Laat de platen een nacht drogen bij kamertemperatuur. Volumes van meer dan één milliliter hebben meer tijd nodig om te drogen.

Spot vervolgens elke plaat met 250 µL E. coli stam OP 50, die gedurende de nacht in LB-medium is gekweekt tot een optische dichtheid van 0,4 tot 0,6, en laat de bacteriën gedurende de nacht bij kamertemperatuur drogen. De ouderdom van de plaat heeft een significant effect op de verlammingsgraad, waarbij oudere platen de neiging hebben uit te drogen. Platen moeten binnen één week voor de verlammingsassay worden gegoten.

Idealiter gebruikt u platen die drie tot vier dagen voor de synchrone ei-afzetting zijn gegoten; de platen die in een experiment worden gebruikt, moeten allemaal uit dezelfde batch komen. Het wijzigen van de grootte van het gazon en/of de bacteriën zal ook het gedrag van de wormen beïnvloeden. Paralyse-assays kunnen worden uitgevoerd met alternatieve E. coli-stammen. Zo wordt HT115 gebruikt in RNAi-experimenten. Dit kan echter de kinetiek van de paralyse-assay veranderen.

Daarom moeten er geschikte interne controles voor de stam worden gebruikt. Stam CL 476 wordt het meest gebruikt voor het analyseren van bèta-geïnduceerde verlamming. Deze stam en andere transgene modellen zijn beschikbaar voor academische onderzoekers tegen een nominale vergoeding via het Saint Ahadi Genetic Center.

Om de leeftijdssynchronisatie van de testpopulatie te maximaliseren, verdient het de voorkeur om te beginnen met een gesynchroniseerde oudergeneratie. Gebruik een week voor aanvang van de verlammingsanalyse van de testpopulatie een platinen wormpicker om 20 tot 30 volwassen wormmen over te brengen naar meerdere NGM-platen van 10 centimeter.

Uitplaten met OP 50 voor een eiafzetperiode van twee uur bij 16 graden Celsius, wat de permissieve temperatuur is voor CL 4 1 76. Verwijder de GR-volwassenen en laat de nakomelingen zeven dagen groeien, zodat ze op dat moment volwassen tweede-daags grave zijn. Tweede-daags gravity.

Volwassenen worden gebruikt om leeftijdssynchrone testpopulaties voor elke experimentele conditie voor te bereiden. Het doel is om triplaatjes te genereren die 50 tot 75 leeftijdssynchrone wormen bevatten met behulp van een platina wormenpicker. Breng 10 tot 12 volwassen wormen van twee dagen oud over naar 60 millimeter NGM-plaatjes met OP 50. Laat de wormen twee uur lang eieren leggen bij 16 °C, verwijder vervolgens de volwassenen en laat de eieren uitkomen en groeien bij 16 °C.

Op dit punt is het raadzaam om iemand die de platen niet gaat scoren deze te laten coderen, zodat de scoring blind is voor de experimentele condities. Het stadium van embryonale ontwikkeling bij het leggen van de eieren, wat voor wild-type wormen onder optimale condities ongeveer het 26-celstadium is, is een functie van de leeftijd van de volwassenen en hun voeding. Als de gebruikte volwassen wormen voor de eierlegger ouder zijn of zijn uitgehongerd, zullen eieren in een later stadium worden gelegd en zal een synchrone populatie niet worden bereikt, wat de kinetiek van de paralyse-assay beïnvloedt.

Het is essentieel dat monogene bacteriële culturen zoals e coli, OP 50 worden gebruikt, omdat bacteriële contaminatie van welke aard dan ook deze assay ernstig kan beïnvloeden. De reproduceerbaarheid is het hoogst als uw triplaatjes een vergelijkbaar aantal wormen bevatten. Om het transgen te induceren en de paralyse-assay uit te voeren, worden de plaatjes opgewarmd naar 25 °C.

48 uur na het einde van de synchrone eiafszetting zouden de wormen zich in het derde larvale stadium moeten bevinden. Platen moeten zonder stapeling in een incubator van 25 °C worden geplaatst, zodat de platen deze temperatuur kunnen bereiken. Begin tegelijkertijd met het scoren van de verlamming van de wormen 18 tot 20 uur nadat de temperatuurverhoging (upshift) is ingezet.

Op dit punt zouden alle wormen in de populatie het vierde larvale stadium moeten hebben bereikt; ga door met het scoren in intervallen van twee uur totdat alle wormen op elk van de platen verlamd zijn. Om onbekende redenen is de verlamming niet gelijkmatig over de lichaamslengte verdeeld. De kopregio is het laatste deel van de worm dat stopt met bewegen.

Wormen die onlangs verlamming hebben vertoond, kunnen dus niet over de plaat verplaatsen, maar kunnen hun koppen nog wel bewegen, waardoor de bacteriën rond hun anterieure uiteinde worden verwijderd en er een halo van vrijgemaakte bacteriën ontstaat. Deze wormen zullen onvermijdelijk volledig verlamd raken, waardoor wormen met halo's worden gekarakteriseerd als verlamd. Sommige wormen zullen geen halo's hebben, maar zullen ook geen spontane beweging vertonen.

Deze worden getest door ze aan te raken met de wormpincet. Als een aangeraakte worm na stimulatie geen volledige lichaamsgolven kan voortplanten, wordt deze voor een efficiënte scoreopname eveneens als verlamd gescoord. Het is het eenvoudigst om de verlamde wormen naar een ongemerkte sector van de plaat te verplaatsen, zodat ze tijdens de volgende scoreperiode niet onbedoeld opnieuw worden gescoord.

Dit stelt ook onjuist gecategoriseerde wormen in staat om beweging te vertonen, waardoor een correctie van de score mogelijk is om een verlammingscurve te genereren. Op elk tijdstip wordt het fractie van de wormen op elke plaat die niet verlamd zijn omgezet in een percentage, en het gemiddelde niet-verlamde percentage wordt uitgezet tegen de tijd vanaf het moment dat de temperatuurovergang (upshift) werd ingezet. De resulterende curve is formeel analoog aan een overlevingscurve en kan daarom worden geanalyseerd met standaard non-parametrische overlevingsstatistiek.

De upshift van de transgene myo-3 Aβ-wormen moet vóór het midden van het L4-stadium worden uitgevoerd om de verlamming te initiëren. De myo-3 promoter is ontwikkelingsregulerend. Zodra de wormen het late L4-stadium of de volwassen fase hebben bereikt, is het expressieniveau aanzienlijk afgenomen.

De expressie van het transgen wordt geblokkeerd als de wormen uithongeren, dus het is essentieel dat de wormen gedurende het hele experiment goed gevoed worden. We hebben nog nooit waargenomen dat een verlamde worm onder enige omstandigheid herstelde. Na 12 tot 16 uur Upshift zal CL 41 76 verlamd raken, ongeacht of u de temperatuur verlaagt naar 16 graden; bij stam CL 41 76 kan de upregulatie van de transgeenexpressie die verlamming veroorzaakt, ook bij lagere temperaturen optreden.

Houd er echter rekening mee dat de timing van de verlammingsgraad zal variëren. De verlammingsgraad is afhankelijk van de specifieke gebruikte transgene stam. We hebben myo drie A beta-stammen ontwikkeld met een verlammingsgraad die sneller en langzamer is dan die van CL 41 76; daarom dient u het beoordelingsvenster voor de verlammingsanalyse dienovereenkomstig aan te passen.

Hier wordt een plot van een verlammingscurve voor CL 4 1 76 getoond, zowel onbehandeld als blootgesteld aan 6,27 millimolair cafeïne. Deze behandeling resulteert in een zeer statistisch significante vertraging van de verlamming van ongeveer vier uur, wat wij interpreteren als een aanwijzing voor de onderdrukking van een beta-toxiciteit. In dit model is in dit experiment gekeken naar de effecten van een andere verbinding die in koffie voorkomt.

De grafiek is typerend voor behandelingen die geen invloed hebben op beta-toxiciteit. Merk op dat in beide experimenten ongeveer de helft van de onbehandelde CL 4 1 76-populaties na 24 uur verlamd is en de verlamming na 28 uur volledig is. Dit zijn typische tijdvakken voor de verlamming van de controle.

Bij CL 4 1 7 6 populaties zijn significante afwijkingen van deze timing indicatief voor gewijzigde omgevingsomstandigheden of spontane deletie van transgene kopieën. Raadpleeg het bijbehorende protocol voor aanvullende informatie over stam CL 4 1 76. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de ouderdom van de platen, het stadium van de wormpopulatie en het vermogen om de verlammingsgraad van de wormen te bepalen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u dit sea elgan-systeem kunt gebruiken om de toxiciteit van bèta-amyloïde zorgvuldig te analyseren. U zou in staat moeten zijn om zeer subtiele effecten op deze toxiciteit te detecteren als gevolg van diverse omgevingsfactoren of medicamenteuze behandelingen. De variabelen die we hebben besproken zijn belangrijk om in de gaten te houden, omdat dit u in staat stelt de analyse zeer reproduceerbaar uit te voeren met een consistente verlammingskinetiek.

Dit is eigenlijk zeer belangrijk als u de resultaten wilt vergelijken die in uw laboratorium op verschillende tijdstippen door verschillende personen zijn behaald, of wanneer u uw resultaten vergelijkt met die van andere onderzoekers die dit modelsysteem gebruiken.