Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

In het Caldwell Lab, ook wel de Worm Shack genoemd, bestuderen we neurologische ziektemechanismen in C. elegans. En na een lange dag vruchtbare experimenten belonen we onszelf met een recreatieve activiteit. Hallo, ik ben Adam Knight, bachelorstudent van het Caldwell Laboratory van de afdeling Biological Sciences aan de University of Alabama.

Vandaag zullen ik en mijn collega's laten zien hoe een assay voor dopaminerge neuronendegeneratie in C. elegans kan worden uitgevoerd. Ik zal een wormstam met dopaminerge neurodegeneratie kruisen met transgene stammen die kandidaat-ziektegerelateerde genen en dopaminerge neuronen overexpresseren. Hallo, ik ben Adam Harrington, promovendus in het Caldwell Lab.

Vandaag laat ik u zien hoe u transgene wormen klaarmaakt voor de analyse van dopamine-neuronen. Hallo, ik ben Shu Amichi en ik ben een promovendus. Hier laat ik u zien hoe u de dopamine-neuronen van C. elegans, genaamd cep- en ade-neuronen, assayt.

Over het algemeen vertonen wormen die alleen GFP in de dopaminerge neuronen tot expressie brengen geen celdood. In aanwezigheid van CLE zul je echter celdood en leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie waarnemen. Met behulp van deze assay kan een transgen worden co-expressie in de dopaminerge neuronen om te bepalen of het de door CLE geïnduceerde toxiciteit kan versterken of onderdrukken. Laten we beginnen.

Voordat de analyse van de dopamine-neuronen wordt uitgevoerd, moeten we eerst de juiste GaN-stammen kruisen om acht wormen te verkrijgen die zowel alphas nucle als GFP tot expressie brengen onder controle van de dopamine-neuron-specifieke promoter dat one op een paringsplaat te plaatsen. Voeg nu twee L4-stadium transgene ca-avertebraten toe die een dopamine-neuron-specifieke expressie van ons kandidaatgen van belang vertonen, evenals expressie van de DS red two fluorescente selecteerbare marker in de lichaamswandspiercellen. Het is belangrijk op te merken dat we voor elk transgeen construct drie stabiele transgene lijnen genereren.

Deze genetische kruising moet individueel worden uitgevoerd voor elk van de drie aparte gecreëerde stabiele lijnen. Verwijder en gooi de mannetjes na twee dagen weg, na nog eens twee tot drie extra dagen. Inspecteer de F1-generatie.

Er zijn verschillende mannelijke nakomelingen en de paring was succesvol. Transfer vervolgens individueel naar nieuwe plaatjes vijf dieren van Aphrodite L4 en vier dieren van elke kruising die zowel de GFP-fluorescente marker, overgeërfd van de mannelijke ouder, als de DS red two fluorescente lichaamswandspier-marker, overgeërfd van de hamadi-ouder, vertonen. De getransfereerde dieren moeten zich in het L4-stadium bevinden om er zeker van te zijn dat ze nog niet zijn gepaard.

Laat de dieren, met de mannelijke dieren aanwezig op de plaat, drie tot vier dagen lang zelf bevruchten om F2-nakomelingen te produceren. Maak nu de F2-nakomelingen schoon om dit te doen. Transfer vijf tot 10 dieren die beide cent-markers vertonen naar hun eigen individuele platen.

Screen vervolgens de F3-generatie op platen waarin honderd procent van de dieren GFP tot expressie brengt in de dopaminerge neuronen en waarin sommige dieren de fluorescente marker DS red two tot expressie brengen in de lichaamswandspiercellen. Deze dieren zijn homozygoot voor de alfa-synucleïne- en GFP-genen en zullen het nieuw gecreëerde transgen ook stabiel overbrengen. Zodra de screening is voltooid, kunnen we overgaan tot de analyse van de dopaminerge neuronen.

Om te beginnen met de neuronanalyse, bereid een vers plaatje voor van de drie dieren die in de vorige stap zijn geïdentificeerd. Stel voor elk van de drie transgene lijnen een plaatje op. Plaats daarnaast de alpha-synuclein GFP-alleenstam als controle en laat de wormen uitgroeien tot volwassenen.

Zodra de wormen volwassen zijn, worden 30 tot 40 transgene dieren van elke lijn overgebracht naar een nieuwe plaat. Laat ze vijf uur lang eitjes leggen bij 20 °C. Verwijder en gooi ze na vijf uur weg.

De volwassen dieren laten de embryo's drie tot vier dagen lang ontwikkelen bij 20 °C totdat ze het L4-stadium bereiken. Selecteer vervolgens ongeveer honderd transgene L4-dieren en breng deze over naar een plaat die 0,04 mg/mL 5-fluor-2'-deoxyuridine bevat.

Dit nucleotide-analoog voorkomt de ontwikkeling van de volgende generatie via inhibitie van de DNA-synthese. Aangezien FDUR-platen lichtgevoelig zijn, dienen ze tegen licht beschermd te worden door de platen afgedekt en volledig ingepakt te houden. Maak een groot agar-kussen voor de analyse van de wormen.

Deze worden vers gebruikt en mogen niet uitdrogen. Leg twee microscoopglaasjes klaar met daarop in de lengte een stukje plakband. Het plakband dient als afstandhouder voor pads van gelijke dikte.

Leg een derde objectglas ertussen op de workbench. Ze zijn nu gepositioneerd. Drie naast elkaar.

Plaats een druppel gesmolten agar op de centrumzijde en leg snel een andere objectglas er loodrecht bovenop en over alle drie de objectglazen. Herhaal dit om meerdere aanvullende pads te maken, zoveel als nodig is voor het aantal te analyseren monsters. Zodra de agar-pads klaar zijn, plaatst u een druppel van 6 µL 3 mM 11-meisoleuthanestheticum op een dekglas van 22 bij 30 mm.

Pak 40 volwassen dieren op in de druppel en keer het dekglas vervolgens om op het agros-kussentje. Herhaal dit voor elk van de andere lijnen. Score 30 dieren per lijn op de aanwezigheid van elke CEP en een D-neuron.

Met behulp van een samengestelde microscoop met epifluorescentie in een filterkubus die visualisatie van FITC of GFP mogelijk maakt, gebruiken we een endo G-F-P-H-Y-Q filterkubus om gegevens op een scoreblad vast te leggen. Wildtype dieren behouden volledig GFP in alle vier de CEP-neuronen en beide ADE-neuronen. Individuele dieren die verlies van D-neuronen vertonen, worden gescoord als bekend wildtype of degenererend.

Deze neuronen worden genoteerd als LG of verlies van GFP. Evenzo kan de mate van degeneratie worden gescoord door het totaal aantal verloren neuronen in elk dier te tellen, alsook de populatie; de analyse wordt nog twee keer herhaald, waarbij per lijn per proef 30 extra dieren worden gebruikt.

Het totale aantal wormen met dopaminerge neuronen van het wildtype uit de drie analyserondes wordt gemiddeld. De statistische analyse voor neuroprotectie wordt vervolgens uitgevoerd met behulp van de student's T-test, waarbij een P-waarde van minder dan 0,05 als significant wordt beschouwd. Om controlewormen te vergelijken met stammen die kandidaatgenen overexpresseren in dopaminerge neuronen, wordt deze analyse op verschillende dagen na de ei-legging uitgevoerd, waarbij de geschikte analysedagen empirisch zijn bepaald.

Zo hebben we vastgesteld dat 77%, 87% en 90% van de alpha CLE plus GFP-dieren gedegenereerde dopamine-neuronen vertonen op respectievelijk dag zes, zeven en 10 na ontwikkeling. Wanneer we daarom voorspellen dat het betreffende transgen de neurodegeneratie kan versterken, zullen we de analyse op dag zes uitvoeren. Evenzo zullen transgenen die de neurodegeneratie mogelijk onderdrukken, op dag zeven en 10 worden geanalyseerd.

We hebben u zojuist laten zien hoe u een assay voor dopamine-neurodegeneratie uitvoert in sea elegance. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om, ten eerste, een geschikte marker te gebruiken voor selectie tijdens genetische kruisingen. Ten tweede, gebruik gezonde mannetjes en L4-larven voor de kruisingen.

En ten slotte: zorg ervoor dat u de CEP- en DE-neuronen zorgvuldig en consistent scoort. Deze procedure stelt u in staat om snel genetische factoren te screenen die de door alpha-alpha-CLE geïnduceerde neurodegeneratie kunnen versterken of onderdrukken. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.