Behavioural Farmacologie in klassieke conditionering van de Proboscis Extension Response in Honingbijen ( Apis mellifera)

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan leren en geheugenvorming. Bij honingbijen is de eerste stap het verzamelen van vrijvliegende bijen uit hun korf. Vervolgens worden de bijen bevestigd aan plastic buisjes.

De derde stap van de procedure is het uitvoeren van klassieke conditionering. Medicijnen kunnen op bepaalde tijdstippen rondom de conditionering worden geïnjecteerd om hun effect op het leren en de vorming van het geheugen te bestuderen. De laatste stap van de procedure is het testen van de geheugenretentie.

Uiteindelijk kunnen veranderingen in het gedrag na medicamenteuze behandeling de moleculaire mechanismen onthullen die ten grond liggen aan leren en geheugenvorming bij honingbijen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van honing en geheugen door de moleculaire mechanismen van geheugenvorming bloot te leggen.

Over het algemeen zullen onderzoekers die nieuw zijn met deze methode tegen problemen aanlopen, omdat de timing van de stimuluspresentatie tijdens de conditionering en het ophalen van de herinnering exact moet zijn. Daarnaast is het voedingsregime van cruciaal belang. De procedure zal worden gedemonstreerd door cutting gearing en Johannes faberg aan promovendi uit mijn laboratorium. Verzamel de dag vóór het experiment, tussen 14:00 en 16:00 uur, bijen met behulp van een UV-lichtdoorlatende plexiglaspiramide.

Zodra u terug bent in het laboratorium, plaatst u de piramide op zijn basis en maakt u de wanden donker met een handdoek, waarbij de top onbedekt blijft. Open de top en houd een glazen vial boven de opening, zodat er één bijen in de vial kan kruipen voordat u deze weer sluit. Herhaal deze procedure totdat alle bijen in de herfst en winter in een glazen vial zijn overgebracht.

Wanneer bijen niet buiten vliegen, wordt een bijenkorf in een net in een kas gehouden; individuele bijen worden direct uit het net gevangen. Gebruik één glazen vial per bij en immobiliseer de bij door de vial gedurende twee en een halve tot drie en een halve minuut op ijs te koelen. Houd de bij nauwlettend in de gaten en haal deze onmiddellijk van het ijs zodra deze stopt met bewegen.

Zet de geïmmobiliseerde bij vast in een klein plastic buisje met plakband. Zorg ervoor dat de bij zijn abdomen vrij kan bewegen, maar niet zijn kop, thorax of poten. Het is daarnaast belangrijk om de nek niet samen te drukken.

Zodra een bij is geprepareerd, plaatst u de buis in een genummerd boorgat op een rek voor een betere hantering en identificatie.

De buisjes worden altijd teruggeplaatst in hetzelfde boorgat. Voer de bijen na de behandeling tussen 16:00 en 18:00 uur op een locatie die gescheiden is van de conditioneringsplaats. Lok de proboscis-extensie-respons of PER uit door de bijen en hun antennes aan te raken.

Laat de bij met een sucrose-oplossing één druppel van ongeveer vier µL van de SRA-oplossing consumeren. Zorg ervoor dat de antennes,het proboscis of de plastic buis van de bij niet worden bevuild. Voer elke bij totdat ze niet langer eten.

Toon een snelle en betrouwbare PER wanneer hun antennes worden aangeraakt met de oplossing. Voed elke bij op de volgende avonden van het experiment vier keer met één druppel sucrose-oplossing. Vul een plastic kom van ongeveer 0,5 tot één centimeter hoog met kraanwater.

Plaats het rek met de vastgezette bijen in de schaal, waarbij lysa-platen als platform dienen. Dek de schaal af met karton en bewaar deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur. De bijen ondergaan de olfactorische conditionering rond 10:00 uur op de ochtend na de verzameling.

30 minuten voor aanvang van het experiment. Plaats het rek met werkbijen in de buurt van de conditioneringsplaats, maar weg van de opening van de uitlaatpijp waar de bijen getraind zullen worden. Bereid vervolgens de conditioneringsstimulus voor in een zuurkast.

Gebruik een filtertip om vier µL kruidnagelolie op een rond filterpapier te pipetteren. Plaats het geparfumeerde filterpapier in een spuit van 20 mL en voeg de zuiger in. Stel de audiospeler in die een akoestisch signaal aan de experimentator zal geven.

Dit garandeert de nauwkeurige timing van de stimulus, de aanvang van de stimulus, het beëindigen van de stimulus, de duur en de plaatsing. Bereid u voor om het gedrag van de bij gedurende de gehele conditionering vast te leggen. Er wordt een positieve score toegekend als de bij haar SSIS uitstrekt tussen de aanvang van de conditioneringsstimulus en de presentatie van de ongeconditioneerde stimulus.

Het passeren van een virtuele lijn tussen de open kaken. Om een acquisitie-trial te starten, selecteert u de bij die getraind moet worden en plaatst u deze gedurende 10 seconden voor de uitlaat. Kort voor het einde van dit interval van tien seconden plaatst u de spuit met de geurstof op drie centimeter afstand van de antennes van de bij. Presenteer de geur gedurende vijf seconden door 20 milliliters lucht door de spuit te duwen.

Introduceer na drie seconden de ongeconditioneerde stimulus door met een vochtig tandenstokje gedoopt in een sucrose-oplossing het ventrale deel van de distale flagellen van beide antennes aan te raken. Zorg ervoor dat er geen oplossing op de bijen of antennes terechtkomt, en laat de bij vervolgens het tandenstokje aflikken. Deze samengestelde stimulus duurt vier seconden, waarna de bijen uit de trainingscontext worden verwijderd en terug in het rek worden geplaatst.

Een trainingspoging duurt 28 seconden, waarbij de geconditioneerde stimulus 13 seconden na aanvang wordt gepresenteerd. Breng de bij terug naar de trainingsplaats na een interval tussen de pogingen van 10 minuten. Voer de tweede van de drie pogingen uit zoals eerder beschreven, en wacht nogmaals 10 minuten voordat de laatste koppeling wordt uitgevoerd.

Nadat de training voor die dag is voltooid, plaatst u de rekken terug in de schaal. Vergeet niet om elke bij vier keer te voeren met één druppel sucroseoplossing van 4 µL tussen 16:00 en 18:00 uur. Zoals eerder gedemonstreerd, kunnen retentietesten worden uitgevoerd in elk interval van minuten tot dagen na de training. Bereid de geheugentest voor door het rek met bijen gedurende 30 minuten nabij de conditioneringsplaats te plaatsen.

Begin de test door een bij gedurende 10 seconden voor de uitlaat te plaatsen. Presenteer de conditionele stimulus gedurende vijf seconden en noteer het voorkomen van een PER. Plaats de rekken na voltooiing van de tests voor die dag terug in de schaal.

Vergeet niet om elke bij vier keer te voeren met één druppel van 4 µL sucrose-oplossing tussen 16:00 en 18:00 uur, zoals eerder gedemonstreerd aan het einde van het volledige experiment; verifieer of de bij nog steeds in staat is om zijn proboscis uit te strekken door een antenne aan te raken met SRA-oplossing om in de analyse te worden opgenomen; de bijen moeten het gehele experiment overleven en een intact PER hebben. In sommige studies worden systemische injecties gebruikt om het effect van farmacologische interventies op het olfactorische geheugen te bestuderen. Deze injecties kunnen op verschillende tijdstippen worden toegediend, afhankelijk van het ontwerp van het experiment.

Maak eerst met een wegwerphypodermische naald een klein gaatje in de cuticula van het achterste deel van de S scootin, nabij de S scootle-spleet boven de vliegspier. Vul vervolgens een glazen capillair met één microliter van de te testen oplossing. Voer het capillair in het gaatje in de cuticula in en injecteer de oplossing in de vliegspier.

Getrainde experimentatoren zijn in staat om elke 30 seconden één B te injecteren, wat een nauwkeurige timing van de injectie en conditionering mogelijk maakt. Hier worden twee experimenten gepresenteerd. Het eerste experiment onderzoekt de impact van een systemische injectie van zoutoplossing, toegediend vóór de training, op het aanleren van een geheugen.

Er zijn drie groepen in deze studie: een A-groep die geen behandeling ontvangt, een groep die een systemische injectie van 1 µL fosfaatgebufferde saline krijgt, of een sham-groep. Deze behandelingen werden 30 minuten voor de training toegediend, zoals hier links wordt getoond. Het percentage dieren dat de geconditioneerde respons vertoonde tijdens de acquisitiefase nam toe gedurende de drie trainingssessies, waarbij geen verschillen tussen de groepen bestonden.

De staafdiagrammen rechts tonen aan dat noch de PBS-injectie, noch de schijnlaesie een effect hadden op de geheugenretentie. 24 uur na de training in het tweede experiment werden injecties toegediend 40 minuten na de training; de bijen werden verdeeld in één groep die zoutoplossing ontving en een andere groep die één microliter van de eiwitsynthese-remmer anisomycine ontving. De staafdiagrammen rechts tonen een duidelijke afname in de geheugenretentie bij bijen die anisomycine ontvingen. Deze resultaten benadrukken het belang van eiwitsynthese bij de vorming van olfactorisch geheugen.

Na deze procedure kunnen elektrofysiologische opnames worden gemaakt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de neurofysiologische basis is van leervermogen en geheugenvorming na de ontwikkeling hiervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van leer- en geheugenonderzoek om de moleculaire en neurofysiologische mechanismen van geheugenvorming bij de honingbij te verkennen.