Een Proboscis Extension Response Protocol voor het onderzoeken van Behavioral Plasticiteit in Insecten: Toepassing op Basic, Biomedische en Landbouwkundig Onderzoek
8 september 2014
Het Proboscis Extension Response (PER) conditioneringsprotocol, ontwikkeld voor de honingbij (Apis mellifera), biedt een ecologisch relevante en gemakkelijk kwantificeerbare manier om verschillende mechanismen van leren bij veel insectensoorten te bestuderen.
Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe gedragsconditionering van een eenvoudige reflexieve respons op voedsel bij honingbijen kan worden geïmplementeerd. Dit wordt bereikt door eerst honingbijen te vangen, ze vast te binden in harnassen, ze een kleine hoeveelheid geheime oplossing te voeren en ze vervolgens te laten wennen aan de beperking. Vervolgens worden kralen geselecteerd voor conditionering die voldoende motivatie vertonen wanneer hun antennes worden aangeraakt met sucrose.
Tijdens conditionering wordt geurpresentatie gekoppeld aan een sucrose-beloning om de geconditioneerde respons op te roepen. Vervolgens meten niet-versterkte proeven de aan- of afwezigheid van de respons, de latentie van de respons en de duur van de respons. De laatste stap is data-analyse en grafische presentatie van de conditionerings- en testproeven.
Deze techniek is met succes toegepast op studies van honingbijenbiologie en gezondheid. Leergedrag is bijzonder gevoelig voor storende behandelingen zoals pesticiden, waardoor het mogelijk wordt om de impact van dit soort behandelingen op het gedrag van honingbijen op sub-dodelijke niveaus te beoordelen. Visuele demonstratie van deze methode helpt bij het begrijpen van de stimulustiming die vereist is voor effectieve conditionering en de veelvoorkomende fouten die de effectiviteit verminderen. Een persoon die nieuw is met deze methode, zal worstelen met de aandacht voor detail die zowel het protocol als de omringende omstandigheden vereisen.
Om te beginnen verzamel arbeidersbijen van de ingang van de kolonie terwijl ze pauzeren voordat ze vertrekken of als ze terugkeren van het foerageren. Vang slechts één bij per flesje. Houd de opening van het flesje horizontaal of naar beneden gericht terwijl u het deksel vastzet om ontsnapping te voorkomen.
Zodra de bijen zijn verzameld, keer terug naar de lab en plaats een paar flesjes per keer in een ijswaterslurry. Zodra een bij onbeweeglijk is, verwijder de fles uit het ijs onmiddellijk om overblootstelling te voorkomen en plaats de bij in een beperkingsharnas. Houd de bij vast met zijn dorsale thorax naar de uitgesneden portie van de houder en zijn kop net boven de bovenkant.
Druk voorzichtig op de bij zodat zijn monddelen verder reiken dan de rand van de houder. Schuif een strook ducttape tussen het hoofd en de thorax aan de dorsale kant en bevestig het vrije uiteinde stevig aan de zijkant van de houder. Zorg ervoor dat het plakband op de harnas glad en strak is.
Er mogen geen merkbare openingen zijn tussen de voorkant van de bijenhouder en het plakband. Als er openingen zijn, kan de bij zijn per bois mogelijk niet goed uitstrekken of kan hij ontsnappen. Laat de bijen ongeveer 30 minuten rusten na het vastbinden voordat ze worden gevoerd.
Vervolgens voer in een gebied ver van de trainingsruimte, elke bij ongeveer drie tot vier microliters van 0,5 molaire sucrose gedurende het interval tussen voeden en conditionering. Plaats de bijen in een rustige ruimte van de lab en in een plastic container met natte papieren handdoeken. Gedurende deze tijd, een paar minuten voordat u begint met conditionering, Testa bes motivatie om te voeren door hun antennes aan te raken met een kleine druppel 0,5 molaire sucrose-oplossing.
Sta hen niet toe om tijdens deze test te voeren. Als ze reageren door hun psis uit te steken, zijn ze waarschijnlijk voldoende gemotiveerd om te leren en kunnen ze worden gebruikt voor het protocol. Wanneer u klaar bent, plaats de glazen geuropnemers in een modelklei houder en pas hem aan zodat de opening in de brede kant direct op de bijen is gericht en 10 E. Het uiteinde van de spuit moet een tot twee centimeter van de bij verwijderd zijn. Plaats de fitting die de cartridge verbindt met de luchtstroombuis en klepsysteem over het smalle uiteinde van de spuit.
Plaats aan het begin van elke proef de geharnasde bij op de pin in de conditioneringsarena met zijn antennes direct op de geurcartridge gericht. Laat de bij 15 tot 25 seconden rusten in de arena voordat u begint met het geurstimulus om hem aan zijn nieuwe omgeving te laten wennen. Druk op de startknop om het timingmechanisme voor geurontvangst te starten.
Controleer de reactie van de bij op de geur na het begin van het stimulus en vóór de presentatie van de ongeconditioneerde stimulus. Sta na elke proef de bij nog 15 tot 25 seconden rusten in het conditioneringsgebied om de initiële geheugenvorming mogelijk te maken. Te vroeg de bij verplaatsen na de proef zal de effectiviteit van elke conditioneringsproef aanzienlijk verminderen.
Om de sucrose te leveren, houd de punt van de naald twee tot drie centimeter van de bij terwijl de geur wordt gepresenteerd. Gebruik de rand van de trainingsarena om te voorkomen dat de spuit schudt, omdat deze beweging de bij kan afleiden. Er zal een voedingssignaal klinken tijdens de presentatie van het geurstimulus.
Zodra het voedingssignaal klinkt, raak de antennes lichtjes aan totdat de bij zich uitstrekt als probos, voer dan de bij. Timing tussen de presentatie van de geur en de presentatie van de sucrose is cruciaal. Idealiter zouden deze twee stimuli kort overlappen.
Als er meer dan een paar seconden verstrijken tussen de presentatie van de geur en de presentatie van de sucrose, zal de prestatie bij conditionering verminderen. Gebruik na conditionering niet-versterkte testproeven om te beoordelen hoe goed de bijen de geconditioneerde associatie onthouden. Stel eerst een videocamera op een statief boven het trainingsgebied in en richt de camera op de voorkant van het hoofd van de bij zodat de antennes en probus scherp in beeld zijn.
Zorg ervoor dat een kleine LED-licht, die de presentatie van het geurstimulus aangeeft, zich in een gebied achter de bij bevindt en waar het zichtbaar is in de video, maar niet voor de bij. Dit maakt het mogelijk om de tijd van geurbegin en -uiteinde tijdens analyse te identificeren. Voor de meest consistente resultaten, gebruik vers bereide geurcartridges voor testen zodra alles is ingesteld.
Begin met testen door de geur te presenteren zoals eerder getoond. Begin met opnemen 20 seconden voordat u de geur presenteert en blijf opnemen gedurende ten minste 20 seconden daarna. Gebruik na het testen videobewerkingssoftware om het antwoord van elke bij op de voorwaarde te stimulus te scoren.
Overzicht
Het conditioneringsprotocol van de Proboscis Extension Response (PER) stelt onderzoekers in staat om leerprocessen bij honingbijen en andere insecten te bestuderen. Deze methode is ecologisch relevant en kwantificeerbaar, waardoor het een waardevol instrument is in gedragsstudies.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Entomologie
Achtergrond
- Het PER-conditioneringsprotocol is ontworpen voor honingbijen (Apis mellifera).
- Deze methode beoordeelt het leergedrag in reactie op voedselprikkels.
- Het is gevoelig voor omgevingsfactoren zoals pesticiden.
- Inzicht in dit gedrag kan bijdragen aan studies over de gezondheid en ecologie van bijen.
Doel van de studie
- Om gedragsconditionering van honingbijen aan te tonen.
- Om de effecten van verschillende stimuli op leerresponsen te evalueren.
- Om een visuele gids te bieden voor de implementatie van het PER-protocol.
Gebruikte methoden
- Vang honingbijen op en fixeer ze in tuigjes.
- Voer de bijen een sucrose-oplossing om het leerproces te stimuleren.
- Koppel de presentatie van geuren aan een sucrosebeloning tijdens de conditionering.
- Voer onbeloonde tests uit om de respons en latentietijd te meten.
Belangrijkste resultaten
- De conditionering van de proboscis-extensiereactie is succesvol verlopen.
- De latentietijd en de duur van de respons zijn effectief gemeten.
- Data-analyse toonde de invloed van timing op het succes van de conditionering aan.
- Veelvoorkomende fouten in het protocol zijn geïdentificeerd en behandeld.
Conclusies
- Het PER-protocol is een betrouwbare methode voor het bestuderen van leervermogen bij honingbijen.
- Aandacht voor detail is cruciaal voor een succesvolle implementatie.
- Deze methode kan helpen bij het beoordelen van de effecten van omgevingsstressoren op het gedrag van bijen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het protocol voor de Proboscis Extension Response (PER) biedt een kwantificeerbare gedragsmatige assay voor het bestuderen van leer- en geheugenmechanismen in insectmodellen, waardoor mechanistische risicoreductie bij doelwitvalidatie in neurogedragsonderzoek mogelijk wordt. De gevoeligheid voor sublethale effecten van omgevingsstressoren ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij het beoordelen van de veiligheid van verbindingen en de ecologische impact. De aanpasbaarheid van de methode over verschillende soorten en de integratie met neurale monitoringinstrumenten verbetert de translationele continuïteit van fundamentele ontdekkingen naar toegepast agrarisch en biomedisch onderzoek.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk met betrekking tot leren, geheugen en sensorische verwerking in insectmodellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door het meten van geconditioneerde reflexmatige reacties op stimuli die gekoppeld zijn aan bekrachtiging.
- Voorspellende waarde: Faciliteert biologische risicoreductie via kwantificeerbare read-outs van gedragsplasticiteit onder gecontroleerde omstandigheden.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare gedragsuitkomsten, inclusief binaire respons, latentie en duurmetriek.
- Operationele waarde: Maakt de assay gereed voor high-throughput screening van verbindingen die de neurale functie of het gedrag beïnvloeden.
- Schaalbaarheid: Compatibel met videogebaseerde scoring en omgevingscontrole voor consistente toepassing in verschillende laboratoria.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de modellering van ziekterelateerde systemen door geur-sucrose-associaties te koppelen aan neurale paden die worden gemoduleerd door pesticiden of toxines.
- Operationele waarde: Biedt een ziekterelateerd systeem voor het evalueren van sublethale gedragseffecten van agrochemicaliën of neuroactieve stoffen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen mechanistische inzichten uit de ontdekkingsfase en preklinische risicobeoordeling in de entomologische en milieutoxicologie.
Pipeline- & workflowintegratie
Het PER-protocol past binnen het ontdekkingscontinuüm door hypothesetesten in vroeg stadium van neurowetenschappelijk onderzoek mogelijk te maken, de ontwikkeling van assays voor neurobehaviorale screening te ondersteunen en translationele beslissingen bij evaluaties van de milieugezondheid en agrochemische veiligheid te informeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van leer- en geheugenmechanismen via gecontroleerde associatieve conditioneringsparadigma's.
- Screening: Levert kwantitatieve gedragsmatige resultaten (aanwezigheid van respons, latentie, duur) die een betrouwbare evaluatie van verbindingen in de neurotoxicologie mogelijk maken.
- Analytics: Genereert meetbare output zoals responskans, latentie tot extensie en duur van de proboscisextensie voor vergelijkende conditieanalyse.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door te modelleren hoe omgevingsstressoren het gedrag veranderen in ecologisch relevante insectsystemen.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar gedragsplatform over verschillende insectensoorten en onderzoekcontexten heen, waardoor redundante ontwikkeling van assays wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in leer- en geheugenpaden te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen laboratoria door gedefinieerde protocollen voor fixatie, stimulus timing en scoring.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij screening in vroege fasen door neurobehaviorale risico's te identificeren vóór arbeidsintensieve ontwikkeling.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van gedragseffecten in niet-doelsoorten, wat bijdraagt aan duurzame R&D-pipelines.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van insecten, gedragsconditionering en videogebaseerde respons-scoring.
- is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder harnassen, geursysteem, sucrose-voedingsapparatuur en video-opnameapparatuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de timing van stimuli, omgevingscontroles en scoringscriteria om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie tussen insectensoorten vanwege variaties in grootte, motivatie en reflexmatige responsdrempels.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van een minutieuze procedurele controle, waarbij afwijkingen in de timing van geur-sucrose de effectiviteit van de conditionering aanzienlijk verminderen.
