Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans

Het algemene doel van het volgende experiment is om op niet-invasieve wijze in real-time metabole veranderingen op het niveau van het hele dier te monitoren binnen de glycolyse, het pyruvaatmetabolisme en de tricarboxylzuurcyclus, die worden veroorzaakt door individuele metabole routes, genetische veranderingen en/of farmacologische behandelingen. Dit wordt bereikt door levende nematoden stabiele isotopen te voeren om voldoende isotopische verrijking in meerdere metabolieten te verkrijgen, waardoor kwantificering van genetische en/of farmacologische veranderingen in intermediaire metabole routes mogelijk wordt. Als tweede stap wordt de isotopische incorporatie in atmosferische en opgeloste koolstofdioxide gemeten via gas ratio massaspectrometrie, wat een directere beoordeling geeft van de intermediaire metabole flux over korte tijdsperioden.

Vervolgens worden monsters verwerkt voor de analyse van vrije aminozuren in de gehele worm met behulp van HPLC, alsofwel voor isotopische verrijking van aminozuren en organische zuren via GCMS, om veranderingen in de metabole flux in nematoden te kwantificeren. Na blootstelling aan stabiele isotopen worden resultaten verkregen die de effecten tonen van variabele blootstellingsduren van isotopen, bacteriële reiniging en alternatieve wormdisruptie in wildtype wormen om de isotopische abundantie in intermediaire metabolieten te onderzoeken. Deze methode kan inzicht bieden in het intermediaire metabolisme.

Het kan ook worden toegepast op onze systemen, zoals zoogdiercellijnen en weefsels. We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we consistente afwijkingen zagen in de analyse van vrije aminozuren in wormen via HPLC, die wezen op een verminderde intermediaire metabole flux in primaire respiratoire functiewijzigingen. Om deze procedure te starten.

Wormen die tijdens de ontwikkeling of in volwassen staat zijn blootgesteld aan een met een stabiele isotoop gelabelde metabolische precursor, worden verzameld in een centrifugebuis van 1,5 milliliter van kunststof. Normaal gesproken verdunnen we de wormen tot een concentratie van 1000 wormen per één milliliter. Voeg 60% perchloorzuur met epsilon-aminocaproïnerzuur als interne standaard toe aan de wormen tot een eindconcentratie van 4% perchloorzuur en 20 nanomolar interne standaard.

Laat de worm vijf minuten bezinken door zwaartekracht, verwijder vervolgens het supernatant en bewaar dit in een andere buis. De volgende stap is een van de meest kritische aspecten van deze procedure. De wormen moeten volledig worden gedisrumpeerd door zeizing voor de analyse van vrije metabolieten. Maal de wormmonsters 15 seconden lang met een plastic homogenisator en een gemotoriseerde boor.

Bevestig de disruptie van de wormen visueel via lichtmicroscopie en herhaal het malen indien nodig. Op deze afbeelding tonen panelen A en B de wormen vóór het malen. In tegenstelling tot panelen C en D, die de wormen na het malen tonen, wordt het eerder bewaarde supernatant overgebracht naar de 1,5 milliliter plastic centrifugebuizen met het wormhomogenaat centrifuge.

Centrifugeer de monsters bij 2.250 RPM (1300 Gs) gedurende vijf minuten. Breng na centrifugatie het supernatant over naar een schone glazen buis van zeven milliliter. Bewaar het pellet voor later gebruik in een proteïneconcentratie-assay.

Voeg nu vier normale kaliumhydroxide toe aan de SUPERNAT tot de pH-waarde van de monsters tussen zeven en acht ligt. Centrifugeer de geneutraliseerde monsters in de glazen buisjes van zeven milliliter bij 2.250 RPM (1300 Gs) gedurende vijf minuten. Om zouten te verwijderen, wordt het supernatant van elk monster overgebracht naar een nieuw glazen buisje van zeven milliliter. De geneutraliseerde monsters kunnen nu worden voorbereid voor metabolietkwantificering via high performance liquid chromatography (HPLC) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GCMS).

Scheid 50 µL van elk geneutraliseerd monster af voor directe injectie in de HPLC. De kwantificering van vrije aminozuren wordt uitgevoerd met precal-derivatisering met een aldehyde en fluorescentiedetectie. Zoals eerder beschreven, zullen de resterende geneutraliseerde monsters worden geëxtraheerd met een ionenuitwisselingshars voor GCMS om de isotopische verrijking in aminozuren en organische zuren te bepalen, zoals weergegeven in de volgende sectie.

Om de kralen voor te bereiden, voegt u een normale zoutzuuroplossing afzonderlijk toe aan G1- en G50-kralen. Roer elke kolf gedurende 30 minuten in bekerglazen van één liter met een magnetische roerder. Was de kralen daarna 10 keer met gedeïoniseerd water totdat de pH van het waswater gelijk is aan de pH van het water.

Vervolgens tonen we onze methode voor het bereiden van op maat gemaakte, goedkope kolommen met glazen pipetten. Kant-en-klare kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar. Om een kolom voor te bereiden, gebruikt u een pincet om een wattenprop net boven het smalste deel van een Pasteur-pipettespits te plaatsen; gebruik G-1 beads voor extractie van organische zuren en G-50 beads.

Vul voor de extractie van aminozuren elke kolom tot ongeveer een derde van de kolomhoogte. Als een monster al een neutrale pH heeft, wordt er niets aan het monster toegevoegd voordat het op de AG 1-kolom wordt aangebracht. Om organische zuren te extraheren ter extractie van aminozuren, voegt u één milliliter 0,1 normaal zoutzuur toe aan het monster voordat het op de AG 50-kolom wordt aangebracht.

Breng nu de eerder voorbereide geneutraliseerde monsters aan op elke kolom. Was elke kolom 10 keer met water tot de wasvloeistoffen neutraal zijn. Elueer na voltooiing van het wassen elke kolom in schone, gelabelde glazen monsterbuisjes van vier milliliter. Voeg voor de extractie van organische zuren drie milliliter drie normaal zoutzuur toe aan de AG 1-kolom.

Dit maakt analyse van isotopenverrijking in het totale aantal gelabelde koolstoffen mogelijk tussen drie koolstofsoorten, vier koolstofsoorten, vijf koolstofsoorten en zes koolstofsoorten. Voeg voor de extractie van aminozuren drie milliliters vier normaal ammoniumhydroxide toe aan een G 50-kolom. Dit maakt analyse van isotopenverrijking in het totale aantal gelabelde koolstoffen mogelijk tussen drie koolstofsoorten en vijf koolstofsoorten.

Nadat zowel de extracties van organische zuren als van aminozuren zijn voltooid, worden de monsterbuisjes gedurende de nacht in een reactive app three verdamper geplaatst totdat ze droog zijn. De monsters worden vervolgens gedereiveerd en geanalyseerd via GCMS, zoals gedetailleerd in de tekst van het protocol. Begin deze procedure door duizend jonge volwassen wormen over te brengen naar een experimentele 35 millimeter NGM-agarplaat die universeel gelabelde koolstof 13 glucose en e coli bevat.

Plaats vervolgens de experimentele NGM-plaat zonder deksel in een op maat gemaakte glazen kamer, voorzien van een goed afgesloten driewegkraan om nauwkeurige bemonstering en vervanging van de atmosfeer mogelijk te maken. Smeer de afdichting waar de optisch transparante glazen schijf op de plaat rust in met hoogvacuümvet.

Sluit de kamer af met de glazen schijf. Noteer de tijd. Beschouw dit als tijd nul; gebruik vervolgens 30 minuten later een spuit van 20 milliliter om 10 milliliter van de atmosfeer uit de glazen kamer af te nemen via de driewegkraan.

Sluit de stopkraan naar de kamer. Breng na het bemonsteren de monstername over naar een vacuümglasbuis met rode dop die één milliliter natriumbicarbonaat in 0,1 molair natriumhydroxide bevat. Spuit vervolgens 10 milliliters lucht via de driewegstopkraan in de glazen kamer. Gebruik een spuit van 20 milliliters en sluit de stopkraan naar de kamer. Herhaal na het opnieuw injecteren van de atmosfeer en vóór het hervatten van de incubatie de bemonstering van de atmosfeer uit de glazen kamer na 60, 90 en 120 minuten.

Analyseer deze atmosferische kooldioxide-monsters op verrijking met gelabelde koolstof met behulp van een gasratio-massaspectrometer zoals beschreven in de tekst van het protocol; stabiele isotopen zijn na twee uur goed opgenomen in jonge volwassen wormen, zoals hier aangetoond door de gemeten gelabelde koolstof in atmosferische kooldioxide en opgeloste worm-kooldioxide in wormen die gevoed zijn met levende of UV-bestraalde gedode OP 50 e coli. De ratio van koolstof-13 kooldioxide ten opzichte van koolstof-12 kooldioxide was groter in de fractie van de opgeloste worm-kooldioxide vergeleken met de vrijgegeven atmosferische kooldioxide. Er werd waargenomen dat langdurige blootstelling aan een stabiel isotoop vanaf het larvale stadium, gevolgd door het schoonmaken van de wormen op NGM-agar zonder bacteriën, leidde tot een verhoogde isotopische verrijking van vrij glutamaat in jonge volwassen wormen.

In deze grafiek stelt L1 de wormen voor die vanaf het L1-larvale stadium tot het 959-cel jongvolwassen stadium zijn gevoed met universeel gelabelde koolstof 13-glucose en OP50-bacteriën; YA stelt de wormen voor die gedurende 48 uur zijn gevoed met koolstof 13-glucose en OP50-bacteriën, beginnend vanaf de eerste dag van de eiafzetting in het jongvolwassen stadium. De x-as geeft het totale aantal gelabelde koolstofatomen in elke glutamaatsoort aan, en de y-as geeft het percentage verrijking aan. Alle dieren werden vrijgemaakt van overtollig isotopisch label voorafgaand aan de verdere monsterbereiding.

Voor GCMS-analyses geven de groene balken wormen aan die zijn schoongemaakt na isotopische blootstelling door twee uur lang voeding met OP 50 E. coli op NGM-platen voorafgaand aan PCA-extractie. De blauwe en grijze balken geven wormen aan die zijn schoongemaakt na isotopische blootstelling op NGM-platen zonder bacteriën gedurende respectievelijk twee of zes uur voorafgaand aan PCA-extractie, ongeacht het tijdsverloop van de isotopische blootstelling. Er werd geen significant verschil in isotopische verrijking in intermediaire metabolieten waargenomen wanneer dieren gedurende twee of zes uur op platen werden schoongemaakt.

In beide isotopische blootstellingsreeksen werd een lagere isotopische verrijking waargenomen in intermediaire metabolieten wanneer de dieren gedurende twee uur werden gereinigd door het voeren van niet-gelabelde bacteriën. Daarom is het optimale reinigingsprotocol voor wormen die zijn gekweekt op NGM-platen met bacteriële uitstrijk en isotoop vastgesteld als reiniging gedurende twee uur op niet-uitgestreken NGM-platen, om het verrijkingspercentage in intermediaire metabolieten te optimaliseren. Na een behandeling van 24 uur in vloeibare cultuur met één zes koolstof 13 glucose zonder bacteriën.

Een vergelijking werd gemaakt van wormmonsters die uitsluitend door sonicatie of door sonicatie in combinatie met malen waren gedisrumpteerd, zoals weergegeven in deze figuur. Wormen die door sonicatie en malen waren gedisrumpteerd, vertoonden een grotere isotopische verrijking dan monsters die alleen door sonicatie waren gedisrumpteerd; uiteindelijk werden levende wormen gevoed met een stabiele isotopische precursor, ofwel tijdens de ontwikkeling vanaf het L1-stadium op platen, of beginnend op de eerste dag van de eiafscheiding als jonge volwassenen gedurende 24 uur in vloeibare cultuur. Dit maakt gevoelige analyse mogelijk van de isotopische verrijking onder metabolieten die indicatief zijn voor de flux via glycolyse en pyruvaatmetabolisme in de tricarboxyliczuurcyclus na de ontwikkeling.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoek naar mitochondriale ziekten om de intermediaire metabole flux in Caenorhabditis elegans te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van stabiele isotopenprofilering van het intermediaire metabolisme en de metabole flux in de nematode C. elegans.