Basis-

In deze video laten we u zien hoe u C. elegans synchroniseert in het L1-stadium. Dit is een eenvoudige methode, maar deze komt zeer veel voor en is daarom erg nuttig, zeker als u nog een beginner bent.

Als u een expert bent in C, vindt u hier wellicht enkele tips om dit protocol te optimaliseren. De basis van de synchronisatie van wormen berust op de relatieve resistentie van embryo's ten opzichte van volwassen wormen tegenover een alkalische hypochlorietoplossing. Hierbij worden deze volwassen wormen, met talrijke embryo's in hun lichaam, geïncubeerd met een hypochlorietoplossing zodat zij worden gedood en alleen de embryo's overblijven.

Het tweede deel van de synchronisatie wordt bereikt door voedseltekort, zodat embryo's, ook al komen ze op verschillende tijdstippen uit, zich niet verder ontwikkelen dan het L1-stadium. De eerste stap om een blitzing-protocol te starten, is het hebben van wormen in het eigelegendstadium, waarbij er verscheidene eieren over de plaat zijn verspreid. Gebruik M9 om de volwassen wormen te herstellen voor de oogst.

Daarnaast kunnen de embryo's die zich al op het oppervlak van de plaat bevinden, worden afgeschraapt met een zacht materiaal, zoals een stukje röntgenfilm, waarna de aanwezige bacteriën met enkele M9-wassing worden weggewassen. Meestal zijn er een paar wassingen voldoende. Zodra de wormen zijn gewassen, kunnen de vers bereide bleekoplossing worden toegevoegd volgens de eigen voorkeuren.

Controleer de incubatietijd terwijl u de buis schudt. U kunt de generatie van de volwassenen volgen onder de stereomicroscoop. Zodra er vrijwel geen karkassen meer zichtbaar zijn, wordt het aangeraden de reactie te stoppen door M nine toe te voegen tot de buis volledig gevuld is.

Voer ter voltooiing van het protocol ten minste drie wasbeurten uit. De eitjes worden in M9-buffer overnacht geïncubeerd met continue agitatie, wat uitkomst mogelijk maakt maar verdere ontwikkeling van de wormen voorkomt. Hoewel synchronisatie bij elke temperatuur tussen 15 en 25 graden kan worden uitgevoerd, wordt 15 aanbevolen.

Aangezien de ontwikkeling trager verloopt, zoals we tijdens de ontwikkeling hebben vermeld, doorloopt elegan vier larvale stadia voordat het volwassen wordt; de tijd hiervoor is afhankelijk van de temperatuur waarbij het wordt gekweekt. Terwijl type C elgan groeitemperaturen tussen 15 en 25 graden tolereert, is de groeisnelheid bij hogere temperaturen hoger.

Bij de hogere temperatuur kunt u zien dat de stadia waarin de wormen zich bevinden na 24 uur verschillen. Bij 15 en 25 graden zien we na 48 uur bij 25 graden al embryo's. We moeten echter meer dan 80 uur wachten om embryo's op het oppervlak van de platen te zien.

Bij het uitvoeren van een blitzing-experiment met wormen die bij 15 °C zijn gekweekt om optimale resultaten te behalen, moeten verschillende zaken in overweging worden genomen. Het is daarnaast belangrijk om wormen te kunnen herkennen die zich in het voor het experiment gewenste stadium bevinden. Daarom laten we zien hoe de stadia kunnen worden onderscheiden op basis van grootte, differentieel interferentiecontrast-microscopie of kleuring.

In deze grafiek is de groeisnelheid van GaN-wormen in relatie tot de temperatuur zichtbaar; zoals we zien, groeien ze veel sneller bij 25 graden. Er bestaat een correlatie tussen de grootte van het dier en de ontwikkeling in zeemilieus. Met de juiste software kunnen dieren worden gemeten en vervolgens worden geclassificeerd in het juiste ontwikkelingsstadium.

Volgens deze grafiek is de positie echter een globale marker voor de ontwikkelingsstadia. Een meer geaccepteerde stadiëring kan worden bereikt door delen van de zaden te observeren, anatomie die kan worden gebruikt en herkend via differentiële interferentiecontrastmicroscopie of DPI-kleuring. In ons laboratorium hebben we dit protocol gebruikt om wormen te synchroniseren voor verschillende experimenten, zoals micro-eieren bij monokleuring, in situ visualisatie en opstrijkkleuring.

Bovendien helpt dit protocol u om contaminatie te voorkomen. Differentiaal-interferentiecontrast- of Nomar-microscopie wordt gebruikt om het contrast te verhogen. Bij ongekleurde transparante monsters worden de dieren levend gemonteerd op een basis van 2% Agros; Agros kan vooraf worden bereid en bij vier graden worden bewaard voor gebruik.

Het kan gesmolten worden en op 65 graden worden gehouden. Zodra de agros gesmolten is, brengt u wat plakband aan op een objectglas en plaatst u deze aan beide zijden van een derde objectglas. Neem voorzichtig wat agros en breng een druppel aan op het objectglas zonder plakband.

Dek de agarplaten af met een andere objectglas die dwars wordt geplaatst. Zodra het pad gestold is, scheid dan de twee objectglazen door er voorzichtig één over de ander te schuiven. Het blokje zal aan één van beide kleven.

Voeg wat Amazon op het plaatje toe om de wormen geïmmobiliseerd te houden. Selecteer enkele wormen onder de dissectiemicroscoop en breng deze over naar de druppel lele. Vermijd beschadiging van het pad.

Neem een dekglas en breng wat nagellak aan op de randen. Plaats het dekglas voorzichtig op dit preparaat om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Het preparaat kan onmiddellijk onder de microscoop worden geobserveerd. Een van de meest herkenbare kenmerken van de anatomie van C. elegans is de vulva.

Bijvoorbeeld, een lava met een kerstboomsvorm is kenmerkend voor het L4-stadium. Gedetailleerde informatie over de anatomie van C. elegans tijdens de ontwikkeling is te vinden op www.orla.org. Tapis-kleuring is een gangbare procedure om individuele cellen te identificeren.

Fixatie met de tunnel is een snelle methode voor het fixeren van wormen. Voor DAPI-kleuring voegt u eerst een druppel M9-buffer toe aan het oppervlak van een microscoopglaasje. Neem enkele wormen direct van de plaat en breng deze over naar de druppel M9.

Verwijder overtollige M9 met een pipet of een zacht weefsel. Voeg een tunnel toe aan de wormen. Herhaal deze handeling.

Zodra de eerste druppel droog is, voegt u wat montage medium met API en de oversleep toe voordat u het preparaat naar de microscoop brengt. De ontwikkeling van de go kan eenvoudig worden geobserveerd in warm stent met api.