Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Traditioneel worden biologische en klinische studies die microscopische analyse op cellulair resolutieniveau vereisen, uitgevoerd door meerdere experimenten parallel te draaien, waarbij individuele monsters op opeenvolgende tijdstippen uit de studie worden verwijderd voor evaluatie via lichtmicroscopie, terwijl confocale, multifoton- en tweede-harmonische microscopie allemaal nuttige technieken zijn voor in situ beeldvorming. De benodigde infrastructuur is complex en duur, met scanning lasersystemen en complexe lichtbronnen. Hier demonstreren wij hoe men in één dag een hoge-resolutie glasvezel micro-endoscoopsysteem kan bouwen, met behulp van standaardcomponenten voor minder dan 5.000 US dollars.

Het platform biedt flexibiliteit wat betreft beeldresolutie, gezichtsveld en werkgolflengte. Eerst wordt een eenvoudig frame voor een epifluorescentiemicroscoop geassembleerd om plaats te bieden aan een lichtbron, optische filters, lenzen, een glasvezelbundel en een CCD-camera. Vervolgens worden de beeldlenzen geïnstalleerd, die een vergroot beeld van de glasvezelbundel op de CCD-camera vormen.

Vervolgens wordt een LED-bron geïnstalleerd met verlichtingsoptiek om fluorescentie-excitatielicht aan het monster te leveren. Ten slotte maakt real-time beeldvorming met de geassembleerde micro-endoscoop details op cellulair niveau zichtbaar van fluorescentie-gelabelde monsters, waaronder in vitro culturen, in vivo diermodellen en menselijke subjecten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals confocale of multiphoton-microscopie is dat deze voldoende eenvoudig en goedkoop is, zodat onderzoekers in diverse vakgebieden deze snel kunnen implementeren en aanpassen aan hun specifieke behoeften.

De hier beschreven micro-endoscoop met hoge resolutie moet worden beschouwd als een basisconfiguratie, waarbij verschillende variaties in assemblage en toepassing mogelijk zijn. Houd bij het selecteren van componenten voor een specifieke toepassing rekening met de inherente relaties binnen de fluorescentiemicroscopie tussen fluorofoorconcentratie, fotobleking door illuminatie, intensiteit, camerasensitiviteit, gain en belichtingstijd. Dit platform is ontworpen voor gebruik met proflavine als fluorescent contrastmiddel, maar kan worden geconfigureerd om met andere fluorescerende kleurstoffen te werken.

Pro flavin is een heldere kernkleuring met respectievelijk een piekabsorptie- en emissiegolflengte van 445 nanometer en 515 nanometer. Bij het gebruik van andere contrastmiddelen dient de gebruiker de excitatie-, emissie- en dichroïsche filters correct te selecteren om het micro-endoscoopsysteem samen te stellen. Begin met het verbinden van twee cage-staven van zes inch met twee cage-staven van 1,5 inch om een paar staven van 7,5 inch lang te vormen. Schroef de staven in één zijde van de vouwspiegelunit en installeer vervolgens een spiegel met een diameter van één inch.

Schroef vervolgens vier staven van 0,5 inch in de tegenoverliggende zijde van de vouwspiegelunit. Schuif de kooi-kubus over de kooistaven van 7,5 inch via de twee onderste doorvoergaatjes. Schroef de staven van twee inch in de zijvlakte van de kooi-kubus.

Bevestig de camera aan een kooiplaat met behulp van een C-mount naar SM1-adapter. Bevestig de kooiplaat op de 0,5 inch kooistangen, vlak met het oppervlak van de inklapspiegelunit. Selecteer een tubuslens met een diameter van één inch om een beeld van de glasvezelbundel op de camera te vormen.

De brandpuntsafstand van de lens moet zo worden gekozen dat de kern van het glasvezelbundel door ten minste twee pixels wordt bemonsterd. Voor de beeldvorming op de camera wordt de lens in een lensbuis van drie inch lengte geplaatst en met een borgring vastgezet. Een haaksleutel is handig voor het aandraaien van borgringen in lange lensbuizen.

Plaats het emissiefilter in de lensbuis van drie inch bovenop de eerste borgring en voeg een tweede ring toe om het filter op zijn plaats te fixeren. Controleer of de oriëntatie van het filter overeenkomt met de conventie die door de fabrikant van het filter is aangegeven. Schroef de lensbuis in de zijde van de cage-kubus die het dichtst bij de CCD-camera ligt.

Deze positie wordt hier ook weergegeven. Let op dat in het diagram deze lens en filter worden getoond zonder lensbuis van drie inch. Sluit voor de duidelijkheid de camera aan op een computer en bekijk het beeld op het scherm.

Richt de kooiassemblage op een object in de verte en schuif de kooikubus langs de rails totdat een scherp beeld van het object verschijnt. Gebruik een schroevendraaier om de vier schroeven aan de zijkanten van de kooikubus aan te draaien. Deze schroeven klemmen de rails vast wanneer ze worden aangedraaid, waardoor de kubus in positie wordt gehouden.

Dit zorgt ervoor dat de tubuslenzen, in combinatie met het objectief met oneindig gecorrigeerde focus, een scherp beeld van de vezelbundel op de camera vormen. Plaats vervolgens de dichroïsche spiegel in de houder en positioneer deze onder een hoek van 45 graden in de cage-kubus. Schroef het objectief via een RMS-naar-SM1-draadadapter en een instelbare lenstube in de zijde van de cage-kubus tegenover de houder van de tubuslenzen.

Schroef daarna een SMA-connector in een cage-plaat en monteer deze op de stangen op ongeveer de werkafstand van het objectief. Bevestig de basisplaat en de eindkap aan de open zijden van de cage-kubus. Monteer vervolgens een LED op een cage-plaat en schuif deze op het uiteinde van de stangen van twee inch.

Plaats een lens in een lensbuis van 0,5 inch, zodanig dat wanneer deze buis in de zijkant van de cage-kubus wordt geschroefd, er een beeld van de LED wordt gevormd dat de achterste apertuur van het objectief vult. Voeg daarnaast het excitatiefilter toe aan de lensbuis. In dit stadium kan een LED-driver worden gebruikt om de intensiteit van het verlichtingslicht met behulp van epoxy te regelen.

Bevestig een SMA-connector voor een 1030 micron vezel aan de 720 micron field of view glasvezelbundel. Voor details over de connectorisatie van glasvezels, raadpleeg T Thor labs, onderdeelnummer FN negen zes. Een handleiding voor de connectorisatie en het polijsten van optische vezels.

Schroef de bundel met SMA-connectorogen in de SMA-aansluiting die op de kooistangen is gemonteerd. Richt het distale uiteinde van de bundel op een breedbandlichtbron; fluorescent verlichting is hiervoor voldoende. Observeer vervolgens het beeld van het proximale vlak van de bundel op de CCD-camera. Pas tot slot de positie van de objectieflens aan door deze in of uit de kooikubus te schroeven.

Totdat het beeld van het vezelbundel in focus verschijnt, moet de individuele oor duidelijk zichtbaar zijn. De ruimtelijke resolutie van het micro-endoscoop kan worden verhoogd door een microlens of lensassemblage aan de distale tip van de vezelbundel te bevestigen. Deze optica zijn zo geconfigureerd dat de tip, in plaats van de bundeltip direct op het weefsel te plaatsen, met een bepaalde vergroting op het weefseloppervlak wordt afgebeeld.

Hierdoor wordt de ruimtelijke bemonsteringsfrequentie verhoogd, die wordt bepaald door de lichtgeleiding van het vezelbundel. De mate van dem-vergroting komt overeen met de toename in ruimtelijke resolutie en leidt tegelijkertijd tot een proportionele afname van het gezichtsveld. Selecteer een grin-lens met de gewenste vergroting en werkafstand voor uw toepassing.

Zorg ervoor dat de diameter van de lens overeenkomt met die van de vezelbundel waarmee u gaat werken. Monteer de vezelbundel en de GRIN-lens op afzonderlijke handmatige positioneerplatforms met drie assen onder een microscoop met lage vergroting of een stereoscoop voor een nauwkeurige uitlijning.

Plaats vervolgens een druppel optische lijm op het oppervlak van ofwel de lens of de vezelbundel. Breng de twee componenten met behulp van de handmatige positioneers in contact. Stel de interface bloot aan UV-licht gedurende de door de fabrikant aanbevolen dosis om de lijm te uitharden.

Om de GRIN-lens en de gebonden interface te beschermen, dient een kort stuk aluminium capillairbuisje te worden gebruikt om de verbinding te omsluiten. Schuif de buis over de verbinding en zet deze vast met een druppel epoxy aan beide uiteinden van de buis; gebruik krimpkous om de assemblage af te ronden. Breng vóór de micro-endoscopische beeldvorming het contrastmiddel aan op de cellen of het weefsel dat moet worden afgebeeld om cellen en culturen te visualiseren.

Verwijder eerst het groeimedium met een pipet. Voeg vervolgens de proflavine-oplossing toe door deze voorzichtig in het putje te pipetteren. Na een korte incubatie van maximaal één minuut wordt de proflavine-oplossing met een pipet verwijderd en weggegooid.

Spoel de cellen door verse PBS-oplossing aan de well toe te voegen en weer te verwijderen; monteer het distale uiteinde van het vezelbundel in een stevige fixture met handmatige positioneringsstadia op de x-, Y- en Z-as voor stabiliteit. Plaats de glasvezelbundel tijdens de beeldvorming, na het aanbrengen van de kleurstof op de cellen of het weefsel, in licht contact met het monster. Bekijk het beeld van de glasvezelbundel op het computerscherm, gebruikmakend van de software die door de camerafabrikant is geleverd of eventuele aangepaste software die u zelf wenst te ontwikkelen.

Pas de belichtingstijd en de gain-instellingen van de camera aan om een beeld met een aanvaardbare helderheid te verkrijgen. Wanneer deze correct is geassembleerd, functioneert de micro-endoscoop als een epiflorescentiemicroscoop die wordt doorgegeven via een coherente glasvezelbundel. Voor optimale beelden moet erop worden gelet dat aan drie essentiële voorwaarden wordt voldaan.

Ten eerste moet het proximale vlak van het vezelbundel worden afgebeeld op de CCD-camera zonder defocus om de volledige resolutie van het systeem te bereiken. Hier wordt een deel van een vezelbundel afgebeeld met een slechte focus, een lichte focus en een goede focus. De optimale focus wordt bepaald door de werkelijke positie van het objectief ten opzichte van het bundelvlak aan te passen.

Ten tweede moet het proximale vlak van het vezelbundel over de volledige diameter uniform worden verlicht. Zoals eerder beschreven, wordt dit bereikt door de verlichtingsoptica te configureren voor cola-verlichting. De hier getoonde afbeelding is verkregen wanneer een uniform fluorescent monster wordt verlicht in deze voorkeursconfiguratie.

Het overeenkomstige resultaat onder kritische verlichting wordt hier getoond. De structuur van de LED wordt afgebeeld op het oppervlak van het vezelbundel, wat resulteert in de verschijning van dit ongewenste patroon dat over de werkelijke monsterstructuur heen is gelegd. Ten derde is het belangrijk om ervoor te zorgen dat zowel de proximale als de distale zijden van het vezelbundel schoon zijn en vrij van krassen en beschadigingen.

In dit voorbeeld is beeldvervuiling gehecht aan het bundelvlak en is er schade zichtbaar in de vorm van een kleine chip op vijf uur langs de omtrek van de vezel. Vervuiling kan van de bundelvlakken worden verwijderd door deze op dezelfde wijze te reinigen als conventionele glasvezelconnectoren, met behulp van lenspapier en isopropanol of standaard reinigingsinstrumenten voor glasvezels. 1483 cellen werden gelabeld met pro flavine en de onbeschermde vezelbundel werd voorzichtig op het monster geplaatst.

In vitro beeldvorming wordt hier getoond waarbij een 2.5 x grin-lens aan de uiteinde van het bundel was bevestigd, wat resulteerde in een verbetering van de ruimtelijke resolutie en een vermindering van het gezichtsveld. In vivo beeldvorming, waarbij een vezelbundel met een buitendiameter van 0.5 millimeter door een 21 gauge naald werd geleid en in het vetweefsel van het melkklierweefsel van een muis werd ingebracht, werd uitgevoerd zoals te zien is in deze film; adipocyten zijn duidelijk zichtbaar met beweging als gevolg van de hartcyclus. In dit voorbeeld werd beeldvorming van het mondslijmvlies bij een gezonde menselijke vrijwilliger uitgevoerd met behulp van een grotere vezelbundel met een buitendiameter van 1.5 millimeter.

In alle voorbeelden werd pro flavine gebruikt als fluorescent contrastmiddel voor kernmarkering. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het ontwerpen en assembleren van een glasvezel-micro-endoscoop voor in vivo fluorescentie-imaging van cellen en weefsels.