Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Deze video demonstreert hoe een confocale scanmicroscoop met videosnelheid kan worden geconstrueerd met behulp van standaard commercieel verkrijgbare componenten. Een confocale scanmicroscoop vertrouwt op de gecoördineerde beweging van twee scanmirrors om de straal over het rastervlak te verplaatsen; licht van de eerste mirror wordt horizontaal gescand over de eerste set relaislenzen, die het terug naar een stationair punt op de tweede scanmirror focust. Dezelfde scanbeweging wordt vervolgens via de scan- en tubuslenzen overgebracht, waardoor de nu uitgebreide lichtbundel op de achteropening van de objectieflens wordt geplaatst.

De tweede spiegel, waarvan de beweging traag is in vergelijking met de eerste spiegel, scant gelijktijdig de Y-as, waardoor scanacties boven en onder het geïllustreerde vlak mogelijk zijn en er een rechthoekig raster op het sampleoppervlak wordt gecreëerd. Het belangrijkste voordeel van dit protocol ten opzichte van de aanschaf van een commercieel beschikbare microscoop is de lage kostprijs en de mogelijkheid om het instrument aan te passen aan de specifieke behoeften van een imagingproject. Bij het werken met elke laser is het essentieel om passende veiligheidsmaatregelen te nemen om oogletsel te voorkomen.

Draag indien mogelijk altijd de juiste laserbeschermingsbril. Toeschouwers en/of onderzoekers die niet actief de straal uitlijnen of ermee werken, moeten altijd een bril dragen. Verwijder alle glimmende en reflecterende horloges of sieraden.

Het belangrijkste is dat u de straal te allen tijde volgt en beheerst door het pad te beëindigen met een straalblokker of een gemonteerd visitekaartje. Dit is vooral van belang bij het uitlijnen van spiegels, aangezien het pad van de straal moeilijk te voorspellen kan zijn. Breng bovendien uw ogen nooit op dezelfde hoogte als het straalpad.

Schakel de laser uit als u het vlak van de straal moet kruisen voordat u de microscoop assembleert. Zorg ervoor dat alle benodigde apparatuur voor de constructie aanwezig is, inclusief het optische breadboard en de beugels van 90 graden, alle spiegels, lenzen en dichroïsche filters, samen met de passende klemmen en montagehardware, beide scanningspiegels en de fotodetector. Het is daarnaast nuttig om een functiegenerator bij de hand te hebben om de scanactie te testen en de spiegels tijdens de uitlijning te manipuleren.

Het wordt daarnaast sterk aanbevolen om de optische plaat vast te bouten voor meer stabiliteit. Begin met de constructie van de microscoop door de pigtail fiber ator in de optische houder te plaatsen en deze assemblage in het midden van de optische plaat te positioneren. Dit komt overeen met de oorsprong van de blauwe straal, zoals hier wordt getoond.

Schakel de lichtbron in. Gebruik de stelschroeven om de straal grof af te stellen, zodat deze zowel horizontaal als verticaal in een rechte lijn loopt. Plaats een iris voor de vezelcollimator.

Pas vervolgens de hoogte van de iris aan zodat de straal door het centrum gaat. Verplaats daarna de iris langs het straalpad weg van de ator. Controleer de uitlijning van de straal.

Gebruik de twee stelschroeven om de straal op het diafragma te herpositioneren indien nodig. Plaats de gemonteerde diic-spiegel in het straalpad, waarbij de laserstraal in het midden van de spiegel is gepositioneerd. Draai de spiegelhouder om de straal onder een hoek van ongeveer 90 graden te reflecteren, waarbij u er zeker van bent dat de hoogte van de straal niet verandert.

Klem de spiegel aan de tafel door de schroeven op de houder aan te draaien. Plaats vervolgens de gemonteerde resonante galvanometrische spiegel in het pad van de laserstraal. Let er hierbij op dat de laserstraal zich precies in het horizontale centrum van het spiegeloppervlak bevindt.

Draai de spiegelhouder zodat de laserstraal onder een hoek van 90 graden wordt gereflecteerd. Stel vervolgens de reflectie van de spiegel grof bij om dezelfde verticale hoogte van de laserstraal te behouden. Plaats daarna twee irissen direct voor de resonante galvo.

Stel vervolgens hun verticale hoogte opnieuw in, waarbij de laserstraal die wordt gereflecteerd door de resonante gal-spiegel als referentie dient. Klem nu de twee irissen in een rechte lijn vast, waarbij de schroefgaten op het optische breadboard als visuele richtlijn dienen. Stel de eerste spiegel in het pad, de dichroïsche spiegel, bij om de straal op de eerste iris te centreren.

Stel vervolgens de tweede spiegel in het pad af. Gebruik de resonante galvo om de straal op de tweede iris te centreren. Stel deze twee spiegels iteratief bij totdat de straal door beide irissen is uitgelijnd.

Controleer of de laserstraal die wordt gereflecteerd door de resonante gal-spiegel nog steeds vanuit het approximate midden van de spiegel wordt gereflecteerd. Als de straal afwijkt, pas dan de houder van de vezelcollimator aan en herhaal de afstellingen waarbij de straal gecentreerd is op beide open diafragma's. De volgende stap is het plaatsen van de twee relaislenzen die het eerste stationaire telecentrische vlak zullen afbeelden op het tweede stationaire telecentrische vlak.

Voor deze specifieke microscoop hebben de geselecteerde lenzen in het eerste relais dezelfde brandpuntsafstand F, waardoor de afstand tussen de twee spiegels hier simpelweg vier F bedraagt. Voor deze opstelling is F gelijk aan 90 millimeter, dus de vier F-positie bevindt zich op 360 millimeter afstand van de scanningspiegel. Om ervoor te zorgen dat de lenzen precies in het midden van de straalpad liggen, plaatst u de eerste lens in het straalpad en kijkt u naar de laserstraalspot op de volgende iris in het straalpad. Pas vervolgens de hoogte van de lens aan zodat het verticale centrum van de straal samenvalt met het centrum van de iris.

Pas vervolgens de positie van de horizontale bundel aan om de bundel in het midden van het diafragma te centreren. Herhaal dit proces met de tweede lens. Daarna wordt de scanningspiegel geïnstalleerd en wordt de microscoop gedraaid om de plaatsing en uitlijning te vergemakkelijken van onderdelen die anders verticaal zouden moeten worden afgesteld.

Om de exacte positie van het tweede telecentrische vlak te bepalen, plaatst u de resonante gal O in de scaneenheid en schakelt u deze in. Gebruik een visitekaartje om het pad van de scanstraal door de twee lenzen te volgen. Het tweede telecentrische vlak bevindt zich ongeveer vier F vanaf de resonante gal O en kan worden geïdentificeerd als de locatie waar de scanstraal stationair lijkt te zijn.

Markeer het breadboard onder deze locatie met een potlood. Zodra het telecentrische vlak is geïdentificeerd, stelt u de ingang van de scanningspiegel in op nul volt en schakelt u de hardware voor de spiegelbesturing in, zodat de spiegel naar zijn neutrale positie keert. Positioneer vervolgens de standaard scanning galil-spiegel op de exacte locatie van het tele-vlak.

Pas de positie van de spiegel aan zodat de straal in het tele-vlak precies het centrum van de scanningspiegel raakt en draai de spiegelhouder vast. Maak nu de borgschroef los waarmee de gal-spiegel is vastgezet en roteer deze, terwijl u erop let dat de straal verticaal voortplant. Zet vervolgens de laser en de scanning-elektronica uit.

Koppel de vezel los en verwijder de scanspiegels. Bevestig vervolgens het tweede breadboard aan het eerste met behulp van montagebeugels van 90 graden.

Draai ten slotte de gehele microscoop voorzichtig zodat het nieuwe breadboard plat ligt en gebruik de klem om de microscoop in positie te fixeren. Sluit de gal o en laser hier opnieuw aan en vergeet niet de gal O terug te zetten naar nul volt. De rest van de voorheen verticale opstelling kan eenvoudig worden uitgevoerd op het platte breadboard.

Vervolgens stellen we de tweede set relaislenzen in, formeel aangeduid als de scanlens en de tubuslens. Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor zeer belangrijke informatie over het kiezen van de juiste combinatie lenzen. Begin met het plaatsen van de lenzen.

Plaats eerst de spiegels die nodig zijn om de straal naar de objectieflens te sturen. Plaats de eerste grote spiegel van twee inch dicht bij de rand van de optische tafel en draai de spiegelhouder zodat de laserstraal ongeveer 90 graden wordt gereflecteerd. Pas de reflectie van de spiegel aan om dezelfde verticale straalhoogte te behouden.

Plaats vervolgens de andere spiegel van twee inch aan de tegenovergestelde rand van de breadboard om de straal in een hoek van 90 graden te richten en gebruik de stelschroeven om deze te fixeren. Stel daarna twee irisdiafragma's in en stel de twee spiegels zoals eerder beschreven af om de straal te centreren. Plaats vervolgens de scannens op zijn brandpuntsafstand van de gal in het straalpad en stel de horizontale en verticale positie ervan bij.

Om de laserspot op de eerste iris tussen de twee spiegels te centreren. Plaats de grote tube lens van twee inch voorzichtig op de juiste afstand van de scanlens en stel de horizontale en verticale positie af om de straal op de eerste iris te centreren. In deze opstelling is de tube lens geplaatst op een afstand van 75 millimeters plus 300 millimeters wanneer alle componenten zijn gemonteerd.

Sluit de gal O aan op de uitgang van een standaard elektrische functiegenerator of regelcircuit, en stel de piek-tot-piekspanningen in op één tot drie volt. Begin vervolgens met het scannen van de twee spiegels met behulp van een visitekaartje. Lokaliseer de laserstraal in het stationaire vlak, 300 millimeter na de tubuslens.

Plaats de objectieflens in het straalpad en zorg ervoor dat de achteropening van de objectieflens zo dicht mogelijk bij het stationaire vlak wordt gepositioneerd. Stel de monsterhouder in en zorg ervoor dat de verplaatsbare Z-as houder de objectiefhouder niet raakt terwijl deze over zijn bereik wordt verplaatst. Om de confocale configuratie, het pinhole en de detector in te stellen, begint u met het loskoppelen van alle voedingen en glasvezelkabels.

Draai de microscoopassemblage zo dat deze opnieuw op de optische tafel rust, waarbij de resonante scanningspiegel wordt vastgehouden. Nadat de vezel opnieuw is aangesloten op de collimator en de standaard scanningspiegel, en de voedings- en besturingskabels zijn aangesloten, stelt u de aansturingsspanning van de standaard scanning gal in op nul volt, zoals voorheen op de tafel; plaats een monster van een heldere kleurstofsandwich tussen twee dekglasplaatjes. Zet vervolgens de laserbron aan en stel de kleurstof scherp.

Stel de lasersterkte zo in dat de fluorescentie zo helder mogelijk is, gebruik hiervoor een visitekaartje. Volg de fluorescerende emissie van het monster via de objectieflens en het scansysteem naar de dichroïsche spiegel, die de laserstraal reflecteert en de fluorescerende emissie doorlaat. Zoek dit fluorescentiesignaal aan de andere zijde van de dichroïsche spiegel.

Dim nu de kamerverlichting. Plaats een spiegel achter de dichroïsche spiegel om de emissie in een hoek van 90 graden te reflecteren. Richt vervolgens, met behulp van een iris met een spiegel, de fluorescentiestraal zo recht en parallel mogelijk aan de breadboard.

Vervolgens wordt de confocale pinhole-unit opgezet met behulp van de spatial filter cage mount-assemblage van Thor Labs. Dit diagram geeft de opstelling weer. De scanningspiegel bevindt zich in stationaire vlakken die telecentrisch zijn ten opzichte van een stationaire objectief.

Samenstellingen van lenzen tussen de stationaire vlakken van het vlak van de achteropening dienen om de gescande bundels door te geven. Het eerste paar lenzen heeft een gelijke brandpuntsafstand en vormt een één-op-één telescoop. Het tweede paar lenzen, formeel bekend als de scanlens en de tubuslens, hoeven geen gelijke brandpuntsafstand te hebben en dienen vaak als een bundel-uitbreidende telescoop om ervoor te zorgen dat de achteropening van het objectief overvuld wordt.

Het licht dat door het monster wordt uitgezonden, reist terug door het scansysteem en gaat door de dichroïsche spiegel. Een kortbrandpuntslens of een objectieflens focust het emissielicht door het confocale pinhole, waarna het door een lens wordt gecollimeerd. Een laatste lens focust de confocaal gefilterde emissie op een fotomultiplicatorbuis.

Plaats de ruimtelijke filtereenheid in lijn met het pad van de emissiestraal, waarbij u er op let dat de eerste brandpuntslenshouder gecentreerd is op de emissiestraal. In dit geval is een ruimtelijke filtereenheid met een pinhole-diameter van 100 microns gekozen. Monteer vervolgens een lens met een korte brandpuntsafstand in de eenheid en verschuif de Z-translatiehouder totdat er een scherpe focus op het pinhole-oppervlak kan worden waargenomen.

Zorg ervoor dat de gehele unit is uitgelijnd langs de rechte lijn die door de fluorescentiestraal wordt bepaald. Klem de unit vast op de optische tafel. Gebruik nu de instelknoppen op de translatiepodium om de twee assen aan te passen en voer een 2D-zoekprocedure uit over het oppervlak van de pinhole-houder om het punt te vinden waar het fluorescentiesignaal door de pinhole maximaal is.

Plaats vervolgens de coatinglens op de koopmontage na het pinhole. Gebruik een visitekaartje om het fluorescente ion te vinden dat door de confocale eenheid gaat en schuif de coatinglens langs de staven totdat de uitgezonden fluorescentie zo goed mogelijk is gecollationeerd. Stel de fotomultiplicatorbuis-assemblage in. Plaats een lens met een brandpuntsafstand van 50 millimeter in het pad van de fluorescentie-emisiebundel en bepaal het brandpunt.

Markeer deze positie op de breadboard. Zet nu de laser volledig uit en positioneer de fotomultiplicatorbuis zodanig dat het venster zich zo dicht mogelijk bij het gemarkeerde brandpunt bevindt. Verbind vervolgens de assemblage met de focuslens met behulp van instelbare lenstubes.

Wikkel donkere tape rond alle onbedekte straalpaden na het pinhole, zet de laser aan en houd het vermogen hiervan extreem laag. Zet de fotomultipliër aan terwijl u zorgvuldig de spanning op de oscilloscoop afleest. Terwijl de laserintensiteit wordt verhoogd, verhoogt u de spanning totdat er een piekachtige uitslag en/of een DC-offset op het scherm van de oscilloscoop te zien is.

Bevestig dat dit signaal inderdaad afkomstig is van fluorescentie door het laservermogen uit te schakelen of de straalpad te blokkeren om een signaalverlies waar te nemen. Lijn ten slotte iteratief de pinhole uit voor een maximaal signaal op de oscilloscoop. Door eerst de Z-positie van de focuslens te manipuleren en vervolgens de YZ-translatiepodia aan te passen, is de hardware van de video-rate microscoop compleet.

Schakel eerst de fotomultiplicatierbuis uit. Sluit nu de spiegels, de aangepaste regelkaarten en de computer aan zoals weergegeven in het bijbehorende geschreven protocol. Dit systeem kan worden aangepast voor het uitvoeren van confocale scannende micro-endoscopie.

Vervang de tafel door een vezelhoudertafel; raadpleeg hiervoor de bijbehorende tekst of details. De voltooide rechtopstaande confocale scannende microscoop en micro-endoscoop moeten eruitzien zoals hier getoond. De laser- en emissiestralen zijn getekend als visuele hulpmiddelen.

Tijdens een micro-endoscopische operatie houdt een vezelhouder de beeldoorvoervezel op zijn plaats voor experimenten. Deze vezelhouder kan eenvoudig worden vervangen door een XY-tafel voor diverse toepassingen. Het hier getoonde rechtopstaande microscopische platform is een representatief testbeeld van een kleine letter m, gedrukt op een wit visitekaartje, vastgelegd met een video rate frame grabber-kaart om beelden te genereren uit het binnenkomende signaal. Gebleekt.

Het witte papier bevat fluorescerende stoffen die gemakkelijk worden geëxciteerd door UV- en blauw licht, wat resulteert in een heldere achtergrond achter het donkere vlak. Voor het opvangen van deze fluorescentie-emissie is een emissiefilter gekozen met een centrum op 515 nanometers. Een geringe vervorming van het beeld is waarneembaar, met name nabij de zijdelingse randen van het beeldkader.

Deze vervorming is het gevolg van het sinusvormige scanpatroon van de gvo-spiegel van acht kilohertz en wordt in detail besproken in het bijbehorende document. Deze video toont voorbeeldgegevens van de videoscan-snelheid, verkregen door een visitekaartje te scannen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een confocale scanning-microscoop met videoscan-snelheid bouwt en uitlijnt.

Vergeet niet dat werken met laserlicht extreem gevaarlijk kan zijn en dat er tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het verwijderen van alle reflecterende sieraden en het vermijden van werken op ooghoogte met de straalweg.