Membraan Potentials, Synaptic Responses, neuronale circuits, Neuromodulatie en Muscle Histologie Met behulp van de rivierkreeftjes: Student Laboratorium Oefeningen

De algemene doelstellingen van de volgende experimenten zijn het begrijpen van de eigenschappen van exciteerbare membranen en de ionische basis van de rustmembraanpotentiaal, en het aanleren van methoden om de membraanpotentiaal te meten, alsook het aantonen van eigenschappen van synaptische transmissie. In één deel van het experiment wordt de rustmembraanpotentiaal gemeten terwijl het extracellulaire kalium wordt gewijzigd. In een ander deel van het experiment worden mechanismen van synaptische differentiatie onderzocht door het registreren van gestimuleerde synaptische responsen in verschillende motorische eenheden.

Vervolgens wordt een neuraal circuit gepresenteerd dat eenvoudig in stand te houden is. Deze preparatie kan worden gebruikt voor zowel het onderwijs als voor onderzoek naar diverse aspecten van een circuit van sensorisch neuron naar CZS naar motorisch neuron naar spier. Deze reeks experimenten demonstreert het gemak van het gebruik van het rivierkreeftmodel om vraagstukken aan te pakken met betrekking tot membraanpotentiaal, synaptische integratie en transmissie, en structurele verschillen tussen spiervezeltypen.

De belangrijkste voordelen van het gebruik van de rivierkreeftpreparaat bij het onderwijzen van elektrofysiologische concepten en technieken zijn de eenvoud van de dissectie, de levensvatbaarheid van het preparaat in een minimale hoeveelheid zoutoplossing, de gemakkelijke verkrijging van synaptische responsen en het gemak waarmee de algemene anatomische rangschikking van de spieren kan worden onderscheiden. Deze technieken kunnen ook worden toegepast op andere preparaten en zullen ons begrip van de synaptische fysiologie en modulatie, alsook de biochemische en structurele verschillen in het gedemonstreerde preparaat, verder vergroten. Om de chirurgische ingreep te beginnen, selecteer een rivierkreeft met een lichaamslengte van ongeveer zes tot 10 centimeter en plaats deze vijf minuten in crushed ice om het dier te anesthetiseren. Om de rivierkreeft te onthoofden, houdt u deze vast bij de achterkant van de kop, waarbij u ervoor zorgt dat uw vingers buiten bereik van de scharen en de mond van de rivierkreeft blijven, en gebruikt u een grote schaar.

Verwijder snel de kop door een schone snede achter de ogen van de rivierkreeft te maken; verwijder de poten en scharen van de rivierkreeft om verwondingen te voorkomen. Verwijder de styli bij de mannetjes en de pleopoden (zwempoten) bij zowel de mannetjes als de vrouwtjes. Voer de kop en de aanhangsels af.

Scheid vervolgens het abdomen van de thorax door een snede te maken langs het gewrichtsvlies dat het abdomen en de thorax verbindt. Bewaar het abdominale gedeelte van de rivierkreeft en gooi de thorax weg; maak vervolgens met de schaar, terwijl u deze iets naar beneden richting de ventrale zijde en in een hoek houdt, een snede in het pantser langs de onderste laterale rand van elke zijde van het abdomen. Let erop dat u niet te diep in de rivierkreeft snijdt.

Volg met een pincet het natuurlijke patroon van de lijnen in het schild van de rivierkreeft die over de gehele lengte van elk segment lopen. Verwijder het ventrale deel van het schild door het omhoog en naar achteren te trekken, waarbij u er zorg voor draagt dat de buikspieren niet worden beschadigd.

Verwijder de flexormusculatuur. Op dit punt is een witte weefselmassa zichtbaar bovenop de diepe flexormusculatuur. Verwijder dit weefsel voorzichtig met een pincet.

Het maag-darmkanaal is nu zichtbaar als een klein buisje dat langs de middellijn van de diepe flexorspieren loopt. Verwijder dit door het bovenaan met een pincet dicht te knijpen en weg te trekken van de buikholte. Knip het maag-darmkanaal aan de onderzijde door aan het uiteinde van de staart.

Spoel de dissectie schoon met zoutoplossing om te voorkomen dat fecale resten de preparatie beïnvloeden. Zet met dissectiepinnen de bovenste en onderste hoeken van de preparatie vast op een met S-guard gecoate Petrischaal. De abdominale extensor spieren liggen nu bloot.

Giet zoutoplossing in de Petrischaal om het preparaat te bedekken totdat de intracellulaire registraties worden uitgevoerd. Plaats de Petrischaal op de microscoop en gebruik was onder de schaal om te voorkomen dat deze verschuift. De opstelling die wordt gebruikt voor intracellulaire registraties wordt in deze figuur getoond.

De juiste verbindingen en instellingen worden gegeven in de bijbehorende tekst. Stel de software voor de laboratoriumgrafieken in volgens de instructies. Plaats, zoals beschreven in de bijbehorende tekst, de aardedraad in het zoutwaterbad.

Plaats de punt van een glazen micropipet gevuld met drie molair kaliumchloride in het zoutbad en test de elektrodeweerstand. De elektrodeweerstand moet tussen 20 en 60 mega ohm liggen. Gebruik de grove knop op de versterker om de lijn op het labdiagram naar nul te verplaatsen onder hoog-intensieve verlichting.

Kijk door de microscoop en identificeer de longitudinale DEM-spieren. Gebruik de elektrodeprobe om de intracellulaire elektrode in een spiervezel van de DEM-spier in te brengen. De elektrode mag slechts nauwelijks in de spiervezel worden ingebracht.

Zorg ervoor dat u niet volledig door de cel heen dringt. Meet de amplitude van het rustpotentiaal. Versleep de M-cursor vanaf de linkerbenedenhoek van het grafiekvenster naar het spoor.

Plaats de markering M op de nullijn en verplaats de cursor naar het laagste punt van het geregistreerde signaal. Het verschil tussen de markering en de actieve cursor wordt rechtsboven op het scherm weergegeven. Deze waarde is de spanning van het rustmembraanpotentiaal.

Deel de geregistreerde spanning door de versterkingsfactor; in dit geval is een versterking van 10 x gebruikt. Reken de spanning vervolgens om van volt naar millivolt. Nadat het rustpotentiaal voor die spiervezel is geregistreerd, kijkt u door de microscoop en verwijdert u voorzichtig de elektrode uit de spiervezel.

Herhaal de intracellulaire registratie bij andere spiervezels. In het volgende deel van dit experiment wordt het effect van het verhogen van de extracellulaire kaliumconcentratie op de rustmembraanpotentiaal gemonitord. Hiervoor worden zes kreeftenzoutoplossingen gebruikt met kaliumconcentraties van 5,4, 20, 40, 60, 80 en 100 millimolair.

Kies tussen de metingen door een spier die niet trekt voor de volgende intracellulaire registratie. Vervang de badoplossing door de volgende, hogere concentratie kaliumchloride-oplossing. Zorg ervoor dat het preparaat elke keer volledig bedekt is.

Registreer de veranderingen in het membraanpotentiaal voor elke oplossing. Het effect van het verhogen van de extracellulaire kaliumconcentratie op het membraanpotentiaal wordt getoond in deze screenshot; zet de rustmembraanpotentialen voor elke kaliumconcentratie uit in een semilogaritmische grafiek van de extracellulaire kaliumconcentratie tegenover het membraanpotentiaal. Lijn het rustpotentiaal uit bij 5.4 millimolar extracellulair kalium.

Vergelijk voor de hypothetische en waargenomen curven de helling van de waargenomen lijn met de helling van de hypothetische lijn. Na het voltooien van deze elektrofysiologische registraties is de volgende stap het onderzoeken van de anatomie van de spiervezels en hun innervatiepatroon. Breng het preparaat over naar de opvangschaal en voeg methyleenblauw toe.

Verwijder na vijf minuten het methyleenblauw en voeg verse rivierkreeftsaltoplossing toe. Zoek de hoofdzenuw die de spieren binnen een segment innerveert. Schets het innervatiepatroon naar de S-E-M-D-E-L 2D EL one- en DEM-spieren in een segment.

Verplaats vervolgens de preparatie naar een zuurkast. Verwijder de zoutoplossing en voeg het fixeermiddel toe. Het fixeermiddel dat hier wordt gebruikt, is een poin-oplossing.

Het doel van de zuurkast is het vermijden van de dampen van het fixatief. Wees zeer voorzichtig dat deze oplossing niet op de huid of in de ogen terechtkomt. Als uw ogen beginnen te branden, spoel uw ogen dan onmiddellijk af bij het oogspoelstation.

Laat de boin-oplossing ongeveer 10 minuten op het preparaat inwerken en vervang de oplossing vervolgens met een pipet door een zoutoplossing. Snijd een dun segment van de DEL one- of DEL two-spier uit. Plaats dit op een objectglas.

Label het preparaatglas. Herhaal de procedure voor de SEM-spier. Gebruik de lichtmicroscoop om het bandenpatroon van de sarcomeren in beide weefselpreparaten te bekijken.

De volgende reeks experimenten onderzoekt hoe synaptische responsen in de buikspieren van de rivierkreeft kunnen worden geregistreerd. Selecteer een andere rivierkreeft en decapiteer deze. Verwijder de thorax en de aanhangsels en leg de abdominale extensorspieren bloot, zoals getoond in de chirurgische ingreep.

Zoek in het eerste gedeelte van deze video met behulp van de microscoop de zenuw die de motorische axonen naar de extensorspieren geleidt. Zoek naar het segment met de meest toegankelijke zenuw. De zenuw is wit en kan zichtbaar worden gemaakt door met een pipette fysiologische zoutoplossing op het preparaat te spuiten of door voorzichtig op het preparaat te blazen.

Dit zorgt ervoor dat de zenuw beweegt, waardoor deze gemakkelijker te identificeren is. Plaats de zuigelektrode, die door de micromanipulator wordt vastgehouden, direct boven de zenuw. Trek voorzichtig aan de spuit om de zenuw in de elektrode te trekken.

Via de microscoop is te zien hoe de zenuw in de elektrode wordt gezogen. Pas de instellingen in de lab chart-software aan zoals gespecificeerd in het bijbehorende artikel. Vul een glazen micro-elektrode met drie molar kaliumchloride en sluit deze aan op de head stage en de power lab.

Gebruik de grove afstelschroef op de versterker om de lijn op het labdiagram naar nul te verplaatsen. Voordat de elektrode wordt ingebracht, moet de schakelaar enkele keren aan- en uitgeschakeld worden. Om de elektrodeweerstand te testen, meet u de amplitude van de resulterende waarden.

Kijk door de microscoop en gebruik de elektrodeprobe om de elektrode in een van de longitudinale spiervezels in te brengen, hetzij DEM, DL1 of DL2. Let erop dat u niet volledig door de spiervezel heen dringt. De preparatie is nu gereed voor het experiment.

De zuigelektrode wordt gebruikt om het segmentale zenuwbundel te stimuleren en de glazen micro-elektrode wordt gebruikt om de synaptische respons van de spiervezel te registreren; activeer de graft-stimulator om de zenuw te stimuleren met een frequentie van 1 Hz voor fasische responsen. Plaats vervolgens de elektrode in een SEL-spiervezel. De SEL is een tonische spier.

Stimuleer de zenuw met korte pulsbursts bij 10 hertz voor tonische responsen. Vergelijk de geregistreerde responsen van de DEL- en SEL-spieren. Let erop dat de fasische DEL-spieren grotere amplitude synaptische responsen vertonen dan de tonische SEL-spieren.

Deze volgende reeks experimenten richt zich op de flexorspieren van de rivierkreeft in plaats van de extensorspieren. Isoleer, beginnend met een nieuwe rivierkreeft, het abdomen zoals getoond in deze chirurgische ingreep. Plaats in het eerste gedeelte van deze video de geïsoleerde staartpreparaat in een met zoutoplossing gevulde Petrischaal en zet de staart en het bovenste gedeelte van het preparaat vast met spelden.

Let op dat voor experimenten met Caro op de tonische flexormusculatuur het ventrale zenuwstreng intact moet blijven. Gebruik een scalpel om een longitudinale incisie te maken door het gewrichtsmembraan tussen twee ribben aan de ventrale zijde van het preparaat. Wees zeer voorzichtig om niet te diep te snijden, aangezien een diepe snede de motorische zenuwwortel kan doorsnijden, om ervoor te zorgen dat de oppervlakkige spieren niet beschadigd raken.

Voer de volgende stap uit. Snijd met een schaar of een scalpel, terwijl u door een microscoop kijkt, horizontaal vanaf de longitudinale snede in de dunne membraanlaag die de spier bedekt. Vergroot de snede om een flap van het gewrichtsmembraan te maken en til de flap omhoog.

Gebruik een schaar om de flap weg te knippen, zodat de oppervlakkige flexorspieren vrijkomen voor intracellulaire registratie vanuit de oppervlakkige flexorspieren. Gebruik dezelfde instrumentatie en opstelling als gebruikt is voor de registratie van het rustmembraanpotentiaal en de synaptische reacties van de abdominale extensors. Gebruik, zoals voorheen, een intracellulaire elektrode gevuld met drie molar kaliumchloride.

Plaats de elektrode in een spiervezel van de oppervlakkige flexorspieren, waarbij u er zorg voor draagt de spier niet volledig te doorsteken. Registreer de spontane activiteit van de EPSP's. Noteer de verschillende grootten van de EPSP's en of er IPSP's aanwezig zijn.

Neem een klein penseel en strijk hiermee voorzichtig langs de rand van de cuticula binnen hetzelfde segment waar de registreerelektrode zich bevindt. Noteer eventuele veranderingen in de frequentie of grootte van de EPSP's als gevolg van de stimulatie, indien er een sterkere respons wordt waargenomen. Dit zou wijzen op de rekrutering van extra motorneuronen die reageren op de verandering in de vuring van de sensorische zenuw.

Vervang zorgvuldig de zoutoplossing door een oplossing die een neuromodulator bevat, zoals 1 µM serotonine, of een zoutoplossing gebubbeld met koolstofdioxide. Herhaal vervolgens de stimulatie met het penseel. Noteer het effect dat het veranderen van de badoplossing heeft op de geregistreerde activiteit.

Vervang de zoutoplossing in het bad weer door normale zoutoplossing en observeer dat de activiteit van de spiervezel terugkeert naar de basislijn. Deze figuur toont EPSP's die zijn geregistreerd in een oppervlakkige flexorspiervezel. Let op de verschillende grootten van de EPSP's.

De volgende fase van dit experiment maakt gebruik van een extracellulaire elektrode om actiepotentialen van motorneuronen te monitoren die reageren op activiteit in het circuit van zintuiglijke zenuw naar CZS naar motorneuron. Begin met het maken van een zuigelektrode om de zintuiglijke zenuwen te stimuleren. Verhit een stuk plastic slang boven een vlam om deze dunner te trekken.

De volgende stap is om de slang terug te trimmen naar de gewenste grootte. Hiervoor moet u naar de zenuw in uw preparaat kijken om de gewenste openingsdiameter voor uw zuigelektrode te bepalen. Afhankelijk van de grootte van de rivierkreeft kunnen de zenuwbundels variëren in grootte van ongeveer 1 mm tot enkele millimeters in diameter.

Knip het uitgerekte gedeelte van de slang af om de opening in de tip de juiste maat te geven om de zenuw vast te houden. Als de opening te groot is, kan de zenuw eruit vallen. Als de opening te klein is, kan de zenuw beschadigd raken door de druk van de elektrode.

Plaats de plastic slang op de punt van een glazen zuigelektrode. De opstelling van de elektrofysiologie en software verschilt enigszins van die voor het monitoren van extracellulaire responsen in vergelijking met de opstelling voor intracellulaire registraties. Gebruik de apparatuur zoals gespecificeerd in het bijbehorende artikel en zuig de derde route die de oppervlakkige flexormusculatuur innerveert in de zuigelektrode.

U kunt nu beginnen met het registreren van actiepotentialen. Deze route bevat vijf exciterende motorneuronen en één inhiberende motorneuron. Stimuleer na het registreren van de basisactiviteit de cuticula met een penseel om de verandering in de gegenereerde actiepotentialen waar te nemen.

Vervang vervolgens de badoplossing door neuromodulatoren zoals serotonine, zoals in het vorige experiment, en registreer elke verandering in de respons. Aanvullende oefeningen worden gegeven in de begeleidende tekst. Deze opname toont de actiepotentialen die zijn geregistreerd van de derde route vóór en tijdens stimulatie van de cuticula met een penseel; vergelijk de frequentie van de actiepotentialen vóór het borstelen met de frequentie tijdens de stimulatie.

Deze opname toont de actiepotentialen die zijn geregistreerd van de derde route in normale fysiologische zoutoplossing en in een serotonine-oplossing. Vergelijk de frequentie van de actiepotentialen in normale fysiologische zoutoplossing met de frequentie in serotonine zoals zojuist getoond. Borstelen verhoogt de vuurfrequentie ten opzichte van de basislijn.

Ook is aangetoond dat serotonine de vuringsfrequentie verhoogt ten opzichte van normale zoutoplossing. Deze figuur laat zien dat wanneer borstelen en serotonine worden gecombineerd, er een nog grotere toename in vuringsfrequentie optreedt. De vergelijking tussen extern afgeleide en theoretisch afgeleide effecten van de externe kaliumconcentratie op het rustmembraanpotentiaal duidt op de invloed van ionen op het membraanpotentiaal.

We hebben u ook laten zien hoe u ntic-responsen kunt registreren bij neuromusculaire juncties van zowel fasische als tonische spieren. Deze technieken kunnen worden ingezet in onderzoekende studentenlaboratoria om fundamentele concepten en fysiologie aan te leren. De technieken die in deze laboratoriumoefening zijn verworven, kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden over andere laboratoriumpreparaten, evenals fysiologische toepassingen met betrekking tot geneeskunde en gezondheidszorg.