Fysiologische Experimenteren met de rivierkreeftjes einddarm: een student practicum

Het algemene doel van dit verslag is om te dienen als hulpmiddel voor gevorderde scholieren en studenten in de bachelorfase van fysiologierichtingen die deelnemen aan fysiologische experimenten. Studenten leren hoe ze contracties in de achterdarm van de rivierkreeft kunnen blootleggen en registreren. Een volgende stap is het excideren van de achterdarm uit het dier, wat de directe toediening van verbindingen mogelijk maakt.

Vervolgens worden de kracht en het ritme van de contracties van de gladde spieren in de hinterdarm gemonitord tijdens het toedienen van verschillende farmacologische middelen om de mechanismen te onderzoeken die de contractiekracht beïnvloeden. Op basis van farmacologische assays en receptor-subtypering worden resultaten verkregen die de werking van modulatoren op de neurale innervatie of direct op de spieren aantonen. Hallo, ik ben Dr. J. Mercier van de afdeling Biological Sciences aan Brock University.

Ik heb de achterdarm van de rivierkreeft gebruikt als preparaat voor onderzoek naar neurotransmitters die viscerale spieren aansturen. Daarnaast heb ik dit preparaat ingezet als educatief hulpmiddel en, als onderdeel van een samenwerking met het laboratorium van Dr. Robin Cooper aan de University of Kentucky, perfectioneren we een aantal door studenten uitgevoerde experimenten voor onderwijsvoorderen. Deze methode kan inzicht bieden in de functie van de achterdarm van de rivierkreeft.

Het kan ook worden toegepast in studies naar ziekten, zoals aandoeningen die betrekking hebben op peristaltische ritmen. Daarnaast kan het worden gebruikt om de mechanismen te beschrijven die ten grondslag liggen aan de modulatie van spier- en neurale innervatie. Studenten leren fysiologische en farmacologische gegevens te interpreteren door het gebruik van farmacologische middelen, neurotransmitters en neurohormonen, en zullen een algemeen begrip van receptorfuncties verkrijgen.

Wat betreft agonisten en antagonisten zullen studenten dosis-responscurves opstellen en gegevens in grafische vorm presenteren voor statistische analyse. Om het dier te anesthetiseren, plaatst u een rivierkreeft met een lichaamslengte van zes tot 10 centimeter gedurende vijf tot 10 minuten op ijs. Houd de geanestheseerde rivierkreeft met één hand achter de scharen vast. Snijd snel van de oogkas naar het midden van de kop aan beide zijden en onthoofd vervolgens de rivierkreeft.

Het bloed van het preparaat zal plakkerig worden wanneer het droogt, was daarom de instrumenten na afloop. Verwijder vervolgens de poten en de klauwen. Snijd daarna de linker- en rechterstaartvinnen af, waarbij de middelste staartvin blijft staan; snijd langs de dorsale zijde van het abdomen tot aan het laatste segment.

Snijd vervolgens langs het laatste segment en aan de andere zijde naar beneden. Verwijder het rugschild. Plaats de gedisseceerde rivierkreeft in de met watten beklede Petrischaal.

Slechte k kreeftenzoutoplossing. Gebruik dissectiepinnen om het preparaat aan de Petrischaal te bevestigen. De achterdarm is gewoonlijk omgeven door een massa bloedvaten en bindweefsel.

Verwijder deze met een pincet, terwijl u er zorg voor draagt dat de darm niet wordt beschadigd. De achterdarm is nu zichtbaar langs het abdomen.

Laat het gedissecteerde kreeftenpreparaat ongeveer 10 minuten in de zoutoplossing rusten, zodat het kan herstellen van de shock van de dissectie en de blootstelling aan de zoutoplossing. Let op de langzame peristaltische contracties van de achterdarm. De contractiesnelheid kan nu worden berekend om te beginnen.

Tel het aantal contracties dat in 30 seconden plaatsvindt en noteer dit in een logboek. Noteer ook het type contracties dat optreedt en of deze peristaltisch of spastisch zijn. Noteer de richting van eventuele peristaltische golven.

Tel de frequentie van de contracties nabij de anus en halverwege het abdomen en bepaal of er verschillen in frequentie bestaan tussen deze twee regio's. Zorg dat er diverse testoplossingen klaarstaan op dezelfde temperatuur als de zoutoplossing voor het bad. De eerste oplossing die hier wordt getest, is één micromolair serotonine bereid in kreeftenzoutoplossing.

Verwijder met een pipet de zoutoplossing uit de holte van het blootgestelde abdomen van de rivierkreeft en breng de ene micromolaire serotonine-oplossing direct aan op de achterdarm. Wacht direct na het toevoegen van de nieuwe oplossing 30 seconden en tel vervolgens gedurende 30 seconden het aantal contracties in de regio nabij de anus, en tel daarna gedurende de volgende 30 seconden het aantal contracties halverwege het abdomen. Noteer deze aantallen in een schema en noteer tevens het type contracties dat optreedt. Volgende.

Giet de testoplossing uit de opnamebak en spoel de achterdarm meerdere keren met normale kreeftensaline. Spoel het preparaat vervolgens gedurende vijf minuten elke 30 seconden. Op dit punt kunt u de volgende testoplossing toevoegen, wat in deze demonstratie één Micromolair Topamine is.

Noteer uw waarnemingen zoals voorheen en herhaal dit proces voor de resterende testverbindingen. Wanneer u meerdere concentraties van dezelfde stof gebruikt, dient u te beginnen met de laagste concentratie en naar hogere concentraties toe te werken. De opstelling om de kracht van de GI-contracties te meten omvat een laptop met LabChart 7-software, de Bridge Pod, de PowerLab 26T en de krachttransducer.

Voordat u de kracht van de contracties van de GI-spieren kunt meten, moet u het maag-darmkanaal isoleren. Om dit te bereiken, snijdt u de spieren in het laatste abdominale segment weg, plaatst u twee of meer spelden door de zachte ventrale cuticula aan weerszijden van de anus en snijdt u vervolgens de rest van het abdomen weg, waarbij de achterdarm en de anus verbonden blijven met een klein stukje cuticula. De darm moet worden doorgesneden vlakbij de overgang tussen het thorax en het abdomen.

Verplaats nu het maag-darmkanaal naar een ondiep schaaltje met een bodem gecoat met sard. Er loopt een bloedvat langs de dorsale zijde van het maag-darmkanaal. Trek dit voorzichtig weg van het maag-darmkanaal.

Giet verse krewelkreeft-zoutoplossing over de preparaat. Verplaats de krachttransducer naar het preparaat. Bekijk de pin die aan de onderkant van de krachttransducer is geplakt nauwkeurig.

Het uiteinde dat aan de darm wordt bevestigd, heeft een kleine buiging. Bevestig de kleine buiging van de pin aan het gesneden uiteinde van de achterdarm. Nadat de achterdarm is bevestigd, verschuift u de schaal voorzichtig totdat de achterdarm gespannen staat.

Wees voorzichtig bij deze stap, aangezien de darm gespannen moet zijn, maar niet te strak. Te veel spanning kan de spier beschadigen. Wanneer de schaal in de optimale positie staat, gebruik dan was of klei om de schaal stabiel te houden.

Start vervolgens de software. Open de LabChart-software om te beginnen met opnemen. Sluit het LabChart Welcome Center.

Ga naar 'setup' linksboven. Klik op 'kanaalinstellingen' linksonder. Pas de kanaalinstellingen aan zodat er slechts één kanaal is.

Klik op oké aan de rechterkant van het scherm. Ga naar kanaal één, open bridge pod. Stel het bereik in op de meest gevoelige stand, in dit geval 200 microvolt, bovenaan de grafiek in de rechterhoek.

Stel de cycli per seconde in op 2K. U kunt nu beginnen met opnemen. Klik op start om te controleren of de opstelling correct werkt.

Raak de tip van de transducer lichtjes aan met een pipet. De software moet een verandering in de geregistreerde kracht laten zien. Klik in de software op stop, klik vervolgens op start en laat het programma lopen.

Klik na ongeveer 20 seconden op stop en voeg een opmerking toe met het label saline. Bereken de contractiesnelheid uitsluitend door de tijd te meten vanaf het begin van één uitslag tot het begin van de volgende, of door het totaal aantal uitslagen over een minuut of twee te tellen. Bereken de snelheid als aantal contracties per minuut of contracties per seconde, afhankelijk van hoe snel ze voorkomen.

Om de contractiekracht te meten, wordt een relatieve maatstaf gebruikt om contracties onder verschillende omstandigheden in het opgeslagen bestand te vergelijken. Verplaats de markering M naar de basislijn, beweeg vervolgens de cursor naar de piek van de uitslag en noteer de waarde rechtsboven op het scherm. Dit is een deltawaarde die het verschil tussen M en de piek weergeeft.

Let op dat de cursor stationair op de piek moet worden gehouden om de verandering te kunnen meten. Verplaats vervolgens de M-marker en de cursor naar de volgende golfvorm van belang en herhaal de meting om het effect van modulatoren te onderzoeken. Schakel bij deze preparatie langzaam over van de zoutoplossing naar een testoplossing.

Voeg in dit geval één micromolaire serotonine toe en blijf de frequentie en kracht van de contracties registreren als laatste test. Test voor deze preparatie of gap junction-remmers de frequentie of kracht van de contracties veranderen; gap junction-remmers omvatten één hep ethanol of een zoutoplossing die is gebubbeld met koolstofdioxide. Deze verbindingen worden als laatste gebruikt, aangezien ze de spiervezels na langdurige blootstelling kunnen beschadigen. Om het effect van de verschillende verbindingen te vergelijken, worden de gegevens in een grafiek uitgezet.

Een andere interessante toepassing van deze preparatie is het registreren van de kracht die door de ringvormige spieren wordt gegenereerd. Indien u echter gap junction-remmers aan uw preparatie heeft toegevoegd, kunnen deze remmers de ringvormige spieren hebben beschadigd; in dat geval dient u een verse preparatie van de achterdarm te gebruiken om de ringvormige spieren te testen. Om de ringvormige spieren bloot te leggen, snijdt u de darmbuis in een longitudinaal vlak open met een fijne schaar.

Gebruik fijne pinnen om één zijde stevig aan de schaal te bevestigen. Bevestig de gehaakte pin van de transducer aan de andere zijde van de strip. Stel het preparaat bloot aan dezelfde verbindingen die op de longitudinale spieren zijn getest; de relatie tussen de geteste verbindingen en het aantal en type contracties wordt hier weergegeven.

U kunt het aantal contracties uitzetten tegen de tijd voor de zoutoplossing, serotonine en glutamaatoplossingen. U kunt het aantal contracties uitzetten tegen de kracht van de contracties in millivolt voor de zoutoplossing, serotonine en glutamaatoplossingen. Deze grafieken kunnen worden gemaakt voor zowel de longitudinale als de circulaire spieren om te testen of de longitudinale en circulaire spieren in de verschillende regio's van het darmkanaal verschillende reacties vertonen op de diverse modulatoren.

De bovenstaande experimenten kunnen worden herhaald op verschillende regio's vanaf de anus en omhoog langs het abdomen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn om het maag-darmkanaal niet te beschadigen met de pincet en om na deze procedure niet te hard te trekken met de krachttransducer. Andere methoden, zoals elektrofysiologische registraties van de spier, kunnen worden uitgevoerd om andere kwesties aan te pakken, zoals ionkanaalfuncties en modulaties, en kunnen dienen als model voor andere weefsels in andere diermodellen.