Western Blotting: Monstervoorbereiding naar Detectie

Het algemene doel van deze procedure is om de eenvoud van het uitvoeren van een Western blot aan te tonen bij gebruik van geschikte producten. Na de monstervoorbereiding worden eiwitten gescheiden op basis van grootte en vervolgens overgebracht naar een vaste fase. De eiwitten worden daarna gesondeerd met antilichamen en gedetecteerd; het gebruik van juiste protocollen en hoogwaardige, kosteneffectieve reagentia leidt tot verbeterde resultaten bij Western blotting.

Hallo, ik ben Jesse Luhan, r&d-wetenschapper bij EMD Chemicals in San Diego, Californië. EMD is een filiaal van Merck, KGAA in Darmstadt, Duitsland. Vandaag gaan we u een western blotting-procedure laten zien.

Laten we beginnen. De eerste stap bij western blotting is de monstervoorbereiding. Start de monstervoorbereiding door de cellen te pelletteren middels centrifugatie bij een lage snelheid, zoals vijf minuten bij 2.500 ×g.

Giet na centrifugatie de celpellets af. Resuspendeer de cellen grondig in cyto buster proteïne-extractiereagens met 150 µL per 10⁶ cellen. Incubeer het monster vijf minuten bij kamertemperatuur.

Centrifuge het monster vervolgens gedurende vijf minuten bij 16.000 ×g bij vier °C. Draag het geklaarde SNA over naar een nieuwe buis en ga verder met de analyse. Nadat de eiwitconcentratie van het monster is bepaald, wordt het monster voorbehandeld voor het laden op de gel om het eiwit te denatureren.

Gebruik een monsterbuffer die een ionisch denaturerend detergent bevat, zoals natriumlaurylsulfaat of SDS. Kook het mengsel vijf minuten lang bij 95 tot 100 °C. Met behulp van een commercieel verkrijgbare precast gel kunnen eiwitten snel worden gescheiden op basis van molecuulgewicht.

Vul de elektroforese-eenheid met running buffer, die kan worden bereid met reagentia uit de Omni PU chemische lijn. Laad de eerste baan van de put met trail mix proteïnemarker. Deze marker heeft drie referentiebanden die monitoring tijdens de elektroforese mogelijk maken.

Zodra de gel is gekleurd, zijn er 10 banden zichtbaar, variërend van 10 tot 225 kilo Daltons. Laad het gedenatureerde monster in de overige putjes. Laat de gel één uur lang lopen bij 220 volt.

Zodra de eiwitten gescheiden zijn, wordt de gel gekleurd met kumasi blue om te controleren of de eiwitten gelijkmatig en uniform zijn gemigreerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van rapid stain en ultrasensitive stain, die klaar zijn voor gebruik zonder DS. Kleuring is noodzakelijk omdat eiwitten met een elektrische lading kunnen worden bewogen door een gel in een elektrisch veld, waardoor de eiwitten in een elektrisch veld van de gel naar een membraan zoals nitrocellulose of PVDF kunnen worden overgebracht. Week bij gebruik van PVDF-membranen het membraan enkele minuten in methanol, gevolgd door een equilibratie in ijskoude transferbuffer gedurende vijf minuten. Week ook de gel enkele minuten in ijskoude transferbuffer; deze equilibratie voorkomt krimp van de gel tijdens de transfer.

Zet voor een natte transfer een sandwich samen van de gel en het membraan tussen spons en papier. Klem de assemblage vervolgens stevig vast, nadat is gecontroleerd of er geen luchtbellen tussen de gel en het membraan zijn ontstaan. Dompel de sandwich onder in transferbuffer en leg een elektrisch veld aan.

De negatief geladen eiwitten zullen naar de positief geladen elektrode migreren. Het membraan stopt hen vervolgens, bindt hen en voorkomt dat zij verder gaan. Zodra de transfer voltooid is, worden de eiwitten gevisualiseerd om een gelijkmatige transfer zonder luchtbellen te bevestigen.

Dit kan eenvoudig worden gedaan met red alert Western blot-kleuring. Deze kleuring is direct klaar voor gebruik en het ontkleuren kan eenvoudig met water worden uitgevoerd. Dit is de gel nadat deze is ontkleurd door te wassen in water; voordat het membraan met antilichamen kan worden aangetoond, wordt het membraan geblokkeerd.

Om aspecifieke binding te voorkomen, dient het membraan te worden geblokkeerd met hoogwaardige blokkeringsreagentia. Om een verhoogde achtergrond te vermijden, wordt het membraan gedurende één uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie geïncubeerd in een blokkeringsoplossing, waarna het membraan na incubatie drie keer wordt gewassen in TBST of PBST. Deze buffers kunnen eenvoudig en gemakkelijk worden bereid met behulp van respectievelijk TBS tween-tabletten en PBS tween-tabletten.

Zodra het membraan is geblokkeerd en gewassen, kan het worden geïncubeerd met het primaire antilichaam. Breng het primaire antilichaam aan met behulp van oplossing één van signal boost, waardoor het signaal aanzienlijk kan worden versterkt. Bereid het primaire antilichaam voor in oplossing één en incubeer het membraan gedurende één uur.

Het is niet nodig om na de incubatie verdere blokkeringsmiddelen toe te voegen. Was de membraan met TBST. Incubeer de membraan vervolgens gedurende één uur met het secundaire antilichaam, verdund in oplossing twee van signal boost.

Was ten slotte het membraan nogmaals meerdere keren met TBST voor de HRP-conjugatie. Voor de detectie van secundaire antilichamen wordt hier traditioneel verbeterde chemiluminescentie of ECL gebruikt. Het ECL-reagens 'rapid step' wordt gebruikt, aangezien dit geen menging van luminol of enhancer vereist.

Spray het membraan simpelweg een paar keer, incubeer gedurende twee minuten en ontwikkel het met röntgenfilm. Rapid Step biedt een gevoeligheid in het lage picogrambereik en een lichtere emissie tot twee uur na de toevoeging van het substraat. Trail mix proteïnemarkers maken proteïne-tracking tijdens elektroforese mogelijk in vergelijking met standaard Western blot-protocollen.

Signal Boost maakt een groter dynamisch bereik en een hogere gevoeligheid mogelijk. Tot slot kan een superieure gevoeligheid worden bereikt door Rapid step te gebruiken in plaats van traditionele ECL-reagentia. We hebben u zojuist laten zien hoe u Western blotting efficiënt en kosteneffectief kunt uitvoeren met een uitgebreid assortiment aan producten.

Onthoud dat de kwaliteit van uw resultaten afhankelijk is van de kwaliteit van uw reagentia. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.