Immunoblot analyse

Immunoblotting, vaak Western blotting genoemd, wordt gebruikt om specifieke antigenen die worden herkend door polyklonale of monoklonale antilichamen binnen een eiwitmonster te identificeren. Deze procedure volgt doorgaans na een 1D- of 2D-gelelektroforese en omvat de overdracht van gescheiden eiwitten naar nitrocellulosemembranen. De membranen worden vervolgens geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen, die direct of indirect geconjugeerd zijn aan enzymen, waarna de eiwitantigenen op deze membranen worden gevisualiseerd met behulp van gekleurde of fluorescerende substraatreacties.

In deze video geven we een stapsgewijze demonstratie van een immunoblottingsprocedure. Hallo, ik ben Sean Gallagher van UVPI, in samenwerking met een proteomisch centrum hier aan het KE Graduate Institute. Vandaag ga ik u de immunoblotting-analyse laten zien.

Het proces omvat een aantal stappen, waaronder eiwitseparatie, blotting van de eiwitten op membranen, immunoprobing en visualisatie met chromogene en chemiluminescente substraten. Laten we beginnen. Voordat de immunoblotting-procedure wordt gestart, moeten de eiwitmonsters eerst worden gescheiden door elektroforese met behulp van kleine of standaardformaat één- of tweedimensionale gels.

Bereid de antigenmonsters voor en breng deze aan in de banen van de gel; voeg vooraf gekleurde of gebiotinyleerde eiwitten en moleculaire gewichtsstandaarden toe in één of meer van de gelbanen. Deze eiwitmarkers worden overgebracht naar het membraan en geven op eenvoudige wijze de oriëntatie van het membraan en de grootte van de eiwitten aan na immunokleuring. Zodra de elektroforese is voltooid, kunnen we de immunoblot samenstellen.

Om de immunoblot te assembleren, demonteer eerst de gelsandwich en verwijder de stapelgel. Laat de gel 30 minuten equilibreren bij kamertemperatuur in transferbuffer; deze equilibratie is noodzakelijk om een verandering in de grootte van de gel tijdens de transfer te voorkomen. Begin met het assembleren van de transfersandwich in een tray die groot genoeg is om de plastic transfercassette te bevatten; vul deze met transferbuffer zodat de cassette bedekt is. Plaats nu een Scotch-Brite pad of spons op de onderste helft van de plastic transfercassette.

Neem vervolgens een vel filterpapier dat op dezelfde grootte als de gel is gesneden. Bevochtig dit vooraf met transferbuffer en plaats het op het scotch bright-kussen. Zodra de gel-equilibratie van 30 minuten is voltooid, wordt de gel bovenop het filterpapier geplaatst.

Verwijder eventuele luchtbellen tussen de gel en het filterpapier door voorzichtig met een reageerbuis of glazen staaf over het oppervlak van de gel te rollen. U kunt ook de BioRad-roller gebruiken, die bij de BioRad-kit is geleverd. Vergeet niet handschoenen te dragen bij het hanteren van filterpapieren, gels en membranen.

Huidvet van uw handen zal de overdracht belemmeren. Bereid vervolgens het transfermembraan voor. Snijd het membraan op dezelfde afmeting als de gel, met een extra marge van één tot twee millimeter aan elke zijde.

Plaats vervolgens het membraan langzaam in gedestilleerd water, waarbij één rand in een hoek van 45 graden wordt gehouden; het water zal in het membraan trekken en uiteindelijk het gehele oppervlak bevochtigen. Als het membraan te snel in het water wordt geplaatst, raakt er lucht ingesloten, wat zichtbaar wordt als witte vlekken in het membraan. Het eiwit zal op deze gebieden niet overbrengen.

Zodra het membraan volledig nat is, laat u het 10 tot 15 minuten equilibreren in transferbuffer. Deze bevochtigingsprocedure is geschikt voor nitrocellulose- en nylonmembranen. Alleen PVDF-membranen zijn hydrofoob en zullen niet simpelweg nat worden door ze in gedestilleerd water of transferbuffer te plaatsen.

PVDF-membranen moeten eerst gedurende één tot twee seconden in 100% methanol worden ondergedompeld en vervolgens 10 tot 15 minuten worden geëquilibreerd in transferbuffer. Laat het membraan op geen enkel moment uitdrogen.

Maak het membraan indien nodig opnieuw nat met methanol en vervolgens met de transferbuffer. Zodra het membraan gereed is, wordt het vochtige membraan direct op de bovenzijde van de gel geplaatst. Vergeet niet alle luchtbellen tussen de gel en het membraan te verwijderen door voorzichtig met een glazen roerstafje of een BioRad-roller over het oppervlak van het membraan te rollen.

Maak vervolgens een ander stuk Watman 3 mm filterpapier nat. Plaats dit op het membraan en verwijder opnieuw alle luchtbellen. Plaats daarna een ander Scotch-Brite pad of een spons bovenop dit filterpapier.

Voltooi de assemblage van de immuno-blot sandwich door het bovenste gedeelte van de transfercassette te vergrendelen. Nu de immuno-blot sandwich is geassembleerd, kunnen de eiwitten van de gel naar het membraan worden overgebracht. Om de transferprocedure te starten, vult u de elektro-blottingtank met transferbuffer en plaatst u de transfercassette die de sandwich bevat in het elektro-blottingapparaat.

Het is belangrijk dat de sandwich zodanig wordt geplaatst dat het membraan naar de anode of de positief geladen zijde van de tank is gericht. Verbind de draden van de voeding met de overeenkomstige anode- en kathodiezijden van het elektroblotting-apparaat. Deze specifieke blotter is voorzien van een koelblok met ijs.

Voer nu de elektroforetische overdracht van eiwitten van gel naar membraan uit gedurende 30 tot 60 minuten bij 50 volt met koeling, of overnacht bij 14 volt in een koelruimte. Schakel de spanningsbron uit zodra de overdracht is voltooid en demonteer het apparaat. Verwijder vervolgens het membraan uit het blotting-apparaat en markeer de oriëntatie door een hoekje af te knippen.

Op dit punt kunnen de membranen worden gedroogd en bewaard in een afsluitbaar plastic zakje bij four degrees Celsius gedurende één jaar. Voor verdere verwerking moeten gedroogde PVDF-membranen in een kleine hoeveelheid 100% methanol worden geplaatst om het membraan te bevochtigen. Vervolgens worden ze in gedestilleerd water geplaatst om de methanol te verwijderen.

Zodra de oriëntatie is gemarkeerd, wordt de gel gekleurd om de transfer-efficiëntie te verifiëren. Om de getransfereerde eiwitten te visualiseren, kunt u het membraan wendbaar kleuren met cipro ruby of onomkeerbaar met kamasi blue India ink, naftolblauw of colloidale goud. Deze onomkeerbare kleurprocedures zijn niet compatibel met nylon membranen.

Nu de eiwitten zijn overgebracht naar het membraan, wordt er voortgegaan met immunoprobing en visuele detectie van de eiwitten. In deze stap worden de geïmmobiliseerde eiwitten op het membraan onderzocht met specifieke antilichamen om eventuele aanwezige antigenen te identificeren en te kwantificeren. Begin hiermee door het membraan in een plastic incubatiebak met 20 milliliters blokkeringsbuffer te plaatsen.

Sommige personen gebruiken zakjes, maar trays worden vaak in plaats daarvan gebruikt, omdat deze vooral handig zijn bij het verwerken van grote aantallen strips in verschillende primaire antilichaamoplossingen. Incubeer vervolgens het verzegelde membraan gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur onder agitatie op een orbitale schudder of een kiepplatform. Terwijl het membraan incubeert, dient u het primaire antilichaam en de blokkeringsbuffer te verdunnen.

De verdunning wordt empirisch bepaald, maar is doorgaans 1:100 tot 1:1000. Voor een polyklonaal antilichaam is dit 1:10 tot 1:100 voor hybridoom-supernatanten en groter dan 1:1000 voor muis-ascitesvloeistof die monoklonale antilichamen bevat. Giet de blokkeringsbuffer af zodra de incubatie is voltooid.

Vervang de buffer door verdunde primaire antilichamen en incubeer opnieuw 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur onder constante agitatie. Was vervolgens het membraan vier keer door te agiteren met 100 milliliters TTBS voor nitrocellulose- of PVDF-filters, of TBS voor nylonfilters.

Was elke keer 10 tot 15 minuten terwijl het membraan wordt gewassen; verdun het secundaire antilichaam in blokkeringsbuffer. Voorbeelden van secundaire antilichamen zijn mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase, anti-IG-conjugaten, commercieel verkrijgbare enzymgeconjugeerde antilichamen. Secundaire antilichamen worden gewoonlijk vóór gebruik verdund van 1:200 tot 1:25.000.

Nadat de wasstappen zijn voltooid en de wasmaterialen zijn weggegooid, voegt u verdunde mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase, anti-IG-conjugaat toe en incubeert u dit 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur onder constante agitatie. Verwijder na 30 tot 60 minuten het membraan uit de bak en was het vier keer, telkens 10 tot 15 minuten, in TTBS zoals eerder beschreven.

Zodra de wasstappen zijn voltooid, kunnen we overgaan tot de visualisatiestap. Maar eerst demonstreer we een alternatieve procedure voor immunodetectie. Deze alternatieve procedure voor immunodetectie is gebaseerd op de Vector Stain ABC-kit van Vector Labs.

Er wordt een avidin-biotinecomplex gebruikt om mierikwasperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP) aan het gebiotineerde secundaire antilichaam te koppelen. Vandaag demonstreren we de HRP-kit. TTBS is zeer geschikt als blokkeringsbuffer voor avidin-biotinesystemen.

Voor nylonfilters worden echter eiwitbindende reagentia aanbevolen, omdat vetarme melkpoeder residuen van biotinine bevat die de immunoassay zullen verstoren. Het mag alleen in de blokkeringsstap worden gebruikt om de membraan te equilibreren in blokkeringsbuffer in een open tray, met constante agitatie met behulp van een orbital shaker of een schudplatform. Incubeer de membraan gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur terwijl de membraan equilibreert.

Bereid de primaire antilichaamoplossing. Gebruik TTBS voor NITROCELLULOSE- of PVDF-membranen met hooggevoelige Aden. Biotine-systemen.

Verdunningsreeksen van sera met primaire antilichamen variëren doorgaans van 1:1000 tot 1:100.000. Het gebruik van chemiluminescente chemie vereist de hogere range van verdunningen. In dit geval tonen we een chromogene methode.

We gebruiken een verdunning van 1 op 5.000 van het primaire antilichaam. Zodra het evenwicht is bereikt, wordt de blokkeringsbuffer verwijderd. Voeg vervolgens voldoende primaire antilichaamoplossing toe om het membraan te bedekken.

Incubeer het membraan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden. Was het membraan drie keer in TTBS voor nitrocellulose met intervallen van vijf minuten. Bereid tijdens de wasstap de gebiotineerde secundaire antilichaamoplossing door één druppel gebiotineerd antilichaam te verdunnen met 10 milliliters TTBS. Voeg de secundaire antilichaamoplossing toe zodra de wasstappen zijn voltooid.

Incubeer het membraan 30 minuten bij kamertemperatuur met langzaam schudden terwijl het membraan wordt geïncubeerd met het secundaire antilichaam. Bereid hiervoor de avadon biotin HRPO voor. Meng twee druppels vti stain reagent A en twee druppels reagent B in 10 milliliter.

TTBS voor nitrocellulose. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur zodra de incubatie met het secundaire antilichaam is voltooid. Was het membraan drie keer gedurende 15 minuten met TTBS of TBS.

Voeg vervolgens de avidan biotine-enzymoplossing toe aan het membraan en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met langzaam schudden. Was het membraan daarna drie keer met TTBS in intervallen van 10 minuten. Nu de immunoprobing-procedure is voltooid, kunnen de aan het membraan gebonden eiwitten worden gevisualiseerd met chromogene substraten.

Voor deze laatste visualisatiestap worden de substraten 4-CN, DAB/ICL2 en TMB gewoonlijk gebruikt bij immunodetectieprocedures op basis van mierikswortelperoxidase. Indien de laatste membraanwas tijdens de immunoprobe-procedure is uitgevoerd in TTBS, was dan het membraan gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 50 ml TBS. Plaats het membraan vervolgens in de chromogene visualisatieoplossing.

Eiwitbanden zouden na 10 tot 30 minuten zichtbaar moeten worden. Gooi na de incubatietijd van 30 minuten het substraatreactiemengsel weg en stop de reactie door gedestilleerd water toe te voegen. Immunoblotting is een procedure in meerdere stappen die door duizenden laboratoria wordt gebruikt om de aanwezigheid van specifieke eiwitten aan te tonen na een 1D- of 2D-elektroforese.

Ik heb u zojuist laten zien hoe u een immuno-bloedanalyse uitvoert. Dat is alles. Veel succes met uw experimenten en bedankt voor het kijken.