Waarom is het meten van de bèta-glucosidase-activiteit belangrijk voor targetvalidatie?

Het meten van de beta-glucosidase-activiteit dient als een functionele readout voor de derepressie van een onderdrukt gen, waardoor kwantificering van de mutatiefrequentie mogelijk wordt die wordt veroorzaakt door replicatiefouten in proofreading-deficiënte polymerasen.

Hoe draagt het isoleren van de onafhankelijke variabele van de polymerase-getrouwheid bij aan de discovery pipeline?

Door de getrouwheid van de polymerase als onafhankelijke variabele te isoleren, kan de impact hiervan op de accumulatie van mutaties direct worden beoordeeld, wat mechanistische risicoanalyse van de genetische stabiliteit in expressiesystemen mogelijk maakt.

Welke kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele maken het mogelijk om de mutatiefrequentie te beoordelen?

Kwantitatieve meting van de beta-glucosidase-activiteit via colorimetrische substraatconversie bij 420 nm biedt een proportionele uitlezing voor de mutatiefrequentie over bacteriële generaties heen.

Waarom zijn replicatievereisten belangrijk voor crossfunctionele samenwerking?

Replicatie over geïnduceerde en niet-geïnduceerde culturen waarborgt een betrouwbare detectie van polymerase-specifieke mutatie-effecten, wat een consistente data-interpretatie tussen discovery- en preklinische teams ondersteunt.

Welke statistische analysevaardigheden zijn vereist vóór de implementatie van deze assay?

De assay vereist baseline-normalisatie, een generatieberekening op basis van kolonie-aantallen en een statistische vergelijking van absorptiewaarden over verschillende tijdspunten om significante veranderingen in de mutatiefrequentie vast te stellen.

Evaluating Mutation Frequency in Bacteria Using the Beta-Glucosidase Assay

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

0 weergaven • 4:00 min • October 30th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Take a culture of genetically modified bacteria.

The bacteria are induced to express a mutant variant of DNA polymerase with defective proofreading activity, which increases the chances of replication error.

These errors can lead to spontaneous mutations in the regulatory region, which derepress the beta-glucosidase gene and trigger the expression of the beta-glucosidase enzyme.

Collect samples at regular time intervals and evaluate the number of bacterial generations in each culture. Centrifuge the samples and discard the supernatant.

Resuspend the pellet in a buffer.

Add a permeabilizing solution and mix to permeabilize the bacterial membrane.

Transfer the permeabilized bacterial samples to a multi-well plate.

Add a substrate that enters the bacteria and reacts with the beta-glucosidase enzyme, producing a colored product.

Measure the color intensity to determine the beta-glucosidase activity.

Analyze the beta-glucosidase activity in the bacterial cultures to determine mutation frequency across generations.

Transfer a single colony of E. coli TOP10 containing the pBAD-ε and the pGOOD1-εD12A11 vectors to one milliliter of LB media treated with antibiotics.

Incubate the culture overnight at 37 degrees Celsius. The next morning, dilute the pre-culture 1 to 250 in three flasks containing 10 milliliters of fresh media. Add the inducers one millimolar each of arabinose, IPTG or arabinose and IPTG, and incubate the induced culture at 37 degrees Celsius for eight hours.

Prepare non-induced cultures in parallel. Collect one milliliter aliquots and dilute them one to 500 in new flasks containing 10 milliliters of fresh media, supplemented or not supplemented with inducers. Then incubate the mixture overnight at 37 degrees Celsius.

The next day, repeat the steps beginning with the dilution of the pre-culture and collect one milliliter aliquots. The aliquots are then placed in the freezer.

Next, determine the number of generations that have occurred in each culture. Transfer 100 microliters of appropriate serial dilutions of inoculum and culture on LB plates.

Incubate the plates overnight at 37 degrees Celsius. The following morning, count the colonies on the LB plates.

Calculate the log of the number of cells present in the inoculum or log I and in the culture at the end of growth or log C, and determine the number of generations.

Then centrifuge the culture at 5,000 gs for 20 minutes and resuspend the cells in one milliliter of 50 millimolar tris HCL, pH 7.6, 50 millimolar NaCl.

To permeabilize the cells, add two to three drops of chloroform and vortex for 20 seconds.

Finally, determine the glucosidase activity of each aliquot in a 96-well microplate.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026

Evaluating Mutation Frequency in Bacteria Using the Beta-Glucosidase Assay

Overzicht

Belangrijke studiecomponenten

Wetenschappelijk vakgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Relevantie voor de industrie

Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & Assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor implementatie

Veelgestelde vragen over Biopharma

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

Meten van microbiële mutatie snelheden met de fluctuatie test

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Transgene knaagdieren Assay voor het kwantificeren van Male Germ Cell Mutant Frequency

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae

Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

Geregisseerd Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing