Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli

Het algemene doel van deze procedure is om een willekeurige mutantenbibliotheek te creëren voor een bepaalde doel-DNA-sequentie, en om mutanten snel te identificeren en te karakteriseren met behulp van semi-kwantitatieve functionele selectie. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide met een coli, één replicatie-oorsprong die de doelsequentie bevat, te transformeren in de mutator-stam. Na het uitplaten en overnacht incuberen van de cellen worden deze geoogst en wordt het doelplasmide geïsoleerd om de mutantenbibliotheek te verkrijgen; deze mutantenbibliotheek wordt vervolgens getransformeerd in een readout-stam om de mutaties te karakteriseren in het tweede deel van het protocol. Er wordt een gradiënt-groeiplaat opgesteld en bacteriële culturen van de readout-stam worden geladen in een aparte Petrischaal met zachte agar.

De laatste stap van de procedure is om deze bacteriële culturen via stempeloverdracht op de gradiënt aan te brengen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in het fenotypische profiel van een specifieke doelsequentie laten zien door verschillen in groei op een geneesmiddelgradiënt. Deze video presenteert een methode voor de gerichte evolutie van eiwitten in e coli.

Dit proces bootst de natuurlijke evolutie na bij de generatie van willekeurige nutriëntenbibliotheken, gevolgd door een selectie die die diversiteit beperkt. Hierdoor wordt ons vermogen verbeterd om nieuwe biochemische activiteiten te genereren voor industriële of biomedische doeleinden. Deze procedure bestaat uit twee componenten: de generatie van een willekeurige mutantenbibliotheek en de functionele selectie om mutations met een gain-of-function te verkrijgen; deze procedure zal worden gedemonstreerd door Jennifer Allen, een technicus uit mijn laboratorium.

Voorafgaand aan de start van dit protocol werden elektrocompetente JS 200-cellen gebruikt die een low-fidelity variant van DNA-polymerase I (low-fidelity pol I) tot expressie brengen, welke vooraf waren geprepareerd zoals beschreven in het geschreven protocol. Deze cellen bevatten een temperatuurgevoelig allel van pol I, zodanig dat de activiteit van low-fidelity pol I domineert bij 37 °C. Constructeer een targetplasmide met een coli-1 replicatieoorsprong, waarbij de targetsequentie naast de replicatieoorsprong is gekloond; low-fidelity pol I initieert de replicatie van het coli-1 plasmide, waardoor mutaties worden geïntroduceerd om mutagenese te initiëren.

Combineer 40 µL electrocompetente cellen en tussen 30 en 250 ng target-plasmadna in een gap van twee millimeter. Elektroporeer het mengsel in de electroporator bij 1800 V. Controleer de tijdconstante of TC om uniforme electroporatiecondities voor elk monster te garanderen.

Ideaal gezien is TC gelijk aan vijf tot zes milliseconden. Laat het mengsel van cel-DNA herstellen in één milliliter LB-bouillon gedurende 40 minuten bij 37 °C onder schudden bij 250 RPM. Neem een 100 millimeter LV agro Petri-schaal, voorverwarmd tot 37 graden Celsius en bevattend de juiste antibiotica voor de selectie van beide plasmiden; plaat de herstelde cellen bij een geschikte verdunning om een concentratie te verkrijgen die dicht bij een gazon ligt, wat gedefinieerd wordt als een duidelijk maar niet telbaar aantal kolonies, zoals weergegeven in dit voorbeeld.

Oogst na een incubatie van één nacht de bacteriële kolonies uit de Petri-schalen met LB-bouillon. Isoleer het plasmide-DNA uit de geoogste cellen; het resulterende plasmide-DNA vormt de willekeurige mutantbibliotheek.

Voer een restrictiedigestie uit door de plasmidenbibliotheek te knippen met een restrictie-enzym dat zowel het doelplasmid als de pole-plasmid lineariseert. Voer een analytische agarosegel-elektroforese uit op het geïsoleerde plasmiden-DNA om de kwaliteit en kwantiteit te bevestigen. Zodra de plasmiden zijn geverifieerd, digesteer dan één microgram van de bibliotheek met een restrictie-enzym dat de pole-plasmid lineariseert, maar het doelplasmid niet knipt.

Nadat de restrictiedigest is voltooid, dient de library te worden gezuiverd met een DNA-zuiveringskit. Transformeer vervolgens de gezuiverde library in een readout-stam om de mutaties te karakteriseren. Om te beginnen met de bereiding van de gradiënt, markeer dan 10 banen die gelijkmatig over één rand van de bodem van de vierkante petrischaal zijn verdeeld.

Plaats de schaal op een helling zodanig dat de onderste gemarkeerde rand zeven millimeter is verhoogd. Giet 25 milliliters warme lb agar, goed gemengd met een passende concentratie van het selectiemiddel, in de hellende schaal. Dit vormt de onderste laag van de gradiënt.

Zorg ervoor dat de LB-agar de petrischaal zodanig bedekt dat het verhoogde, gemerkte uiteinde van de schaal ongeveer één millimeter LB-agar bevat en het verlaagde gedeelte ongeveer acht millimeter. Dek de plaat af met het deksel KU voor ventilatie en laat de agar 10 tot 15 minuten uitharden. Nadat de onderste laag LB-agar is gestold, wordt de schaal naar een vlak oppervlak verplaatst.

Giet vervolgens 25 milliliters warme lb agar zonder het selectiemiddel over het eerste agar-oppervlak, waarbij u ervoor zorgt dat de gehele onderste laag wordt bedekt. Sluit de plaat af met het deksel voor ventilatie en laat de agar 10 tot 15 minuten uitharden om de stempeloverdracht van bacteriën uit te voeren. Verkrijg eerst bacteriële culturen van de readout-stam en verdun deze zodat ze identieke celdichtheden hebben met een optische dichtheid bij 600 nanometers van minder dan 1,0.

Breng vervolgens twee milliliters vloeibare zachte agar, geëquilibreerd op 42 °C, aan op de bodem van een ronde Petri-schaal van 100 millimeter; pipetteer 40 µL van de bacteriële cultuur in de zachte agar en meng dit door de schaal te wiegen. Bedek de lange rand van het glazen microscoopglas met het zachte mengsel. Lijn vervolgens de bedekte rand van het glas uit met de onderste markering op de gradientschaal.

Raak met het objectglas het oppervlak van de agar aan. Een lichte aanraking is voldoende om een strook van de zachte agar over te brengen naar het gradientoppervlak. Het objectglas wordt vervolgens terzijde gelegd om te worden gereinigd en hergebruikt.

Herhaal dit proces. De overige monsters en experimentele controles moeten op elke gradientschaal worden aangebracht. Als er meerdere gradiënten worden uitgevoerd, wordt de gradientschaal 's nachts ondersteboven geïncubeerd bij 37 °C. De incubatietijden en -temperaturen kunnen variëren voor verschillende readout-bacteriestammen, maar incubatie gedurende de nacht bij 37 °C is doorgaans voldoende voor zichtbare groei.

Beeld tenslotte de celgroei en analyseer deze zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Hier zijn afbeeldingen van een readout-stam getransformeerd met respectievelijk ongemuteerde P-G-F-U-V of een PGFPUV-mutantenbibliotheek die vier ronden van mutagenese hebben ondergaan. Donkere of zwakke kolonies duiden op plasmiden die GFP-inactiverende mutaties bevatten.

Deze figuur geeft de frequentie van mutaties weer gedurende de neutrale sequentie van het doelplasmid in intervallen van 100 baseparen. Merk op dat de mutaties over de gehele plasmidsequentie voorkomen, maar met de hoogste frequentie nabij de replicatieoorsprong. Hier wordt de groei van mutanten getoond tegen een gradiënt van een geneesmiddel.

De afstand die naar de bovenkant van de gradiënt is gegroeid, geeft het differentiële profiel van drugresistentie tussen de mutanten aan. In dit voorbeeld werden plasmidenbibliotheken van het menselijke oxidatieve demethylase ABH2 gescreend op mutanten met een verhoogde resistentie tegen methylmethaansulfonaat met behulp van drugselectiegradiënten. Bibliotheken die twee en vier iteraties van het mutageneseprotocol vertegenwoordigen, worden getoond in vergelijking met het ouderlijke wildtype en de lege vector.

De witte lijn geeft de drempelwaarde aan waarboven individuele mutantkolonies werden geïsoleerd. Voor verdere fenotypische analyse worden bèta-lactamasemutanten, R 1 64 H en E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, die eerder zijn geïdentificeerd met behulp van low-fidelity P one mutagenese en astri en m selectie, getoond op een 0,4 µg/mL en een 4 µg/mL cefotaximegradiënt. Bescherming tegen cefotaxime is indicatief voor extended-spectrum bèta-lactamaseactiviteit.

Let op dat het wildtype bèta-lactamase-enzym geen bescherming biedt in vergelijking met cellen die een lege vector tot expressie brengen. Daarom vertegenwoordigen deze mutanten een adaptatie of de evolutie van een nieuwe biochemische activiteit. Hier hebben we een krachtige combinatie van mutagenese en functionele selectie gepresenteerd voor deze generatie van nieuwe biochemische activiteiten.

Een functionele selectie kan worden verkregen via medicijnselectie of via genetische complementatie, en maakt gebruik van ons vermogen om een grote genetische diversiteit te genereren. De pathogenese moet mogelijk worden beperkt tot een bepaalde sequentie om reeds bestaande eiwitactiviteiten te optimaliseren of voor site-directed pathogenese. Deze kunnen eenvoudig worden uitgevoerd door middel van klonering.

Daarnaast kan mutagenese worden losgekoppeld van een functionele selectie om handtekeningaanvallen of mutationele voetafdrukken te verkrijgen.