Microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de fabricage en werking van een microfluidisch apparaat dat tumor-micro-omgevingen in vitro nabootst en gebruikt kan worden voor het testen van chemotherapeutica. Dit is het microfluidische apparaat. Dit apparaat kan nuttig zijn in de volgende gebieden: eenvoudig testen van chemotherapeutica in vitro.

Het levert consistente en nauwkeurige resultaten bij het testen van driedimensionaal tumorweefsel, en dit apparaat biedt een zeer getrouwe weergave van een tumor in vivo. Tumoren bestaan in 3D-micro-omgevingen, en de mogelijkheid om in een dergelijke omgeving te testen is van groot belang. De eerste stap van de procedure is het assembleren van het apparaat, wat het fabriceren van de microfluïdische chip via soft lithography omvat, het ponsen van gaten bij de in- en uitlaten, het hechten aan een glazen objectglas en het aansluiten van slangetjes voor de instroom en uitstroom.

Vervolgens worden uniforme multicellular tumor spheroids gegenereerd voor gebruik in het device via de hanging drop-methode. De spheroids worden vervolgens in het device geïntroduceerd, gevolgd door apoptose, detectie-agentia en chemotherapeutische geneesmiddelen. Tot slot wordt time lapse-microscopie uitgevoerd, gevolgd door een wiskundige schatting van de diffusiecoëfficiënten van het geneesmiddel om het penetratievermogen van het chemotherapeutische agens te kwantificeren.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die, door middel van time-lapse fluorescentiemicroscopie, weefselgroei in het apparaat, de vorming van heterogene micro-omgevingen binnen het weefsel en drugdiffusie in het weefsel aantonen. Beperkte penetratie van kankermedicijnen in solide tumoren is een belangrijke oorzaak van hun falen. De meeste huidige testmodellen voor kankermedicijnen bootsen de driedimensionale aard van solide tumoren niet na.

We hebben een microfluïdisch apparaat ontwikkeld dat bestaat uit continu geperfuseerde driedimensionale tumorgewevens. Dit model geeft een nauwkeuriger weergave van de toediening van geneesmiddelen aan solide tumoren en de systemische klaring daarvan. Multicellulaire tumorsferoïden zijn een goed gevestigd model voor driedimensionale tumorgewevens.

In deze procedure wordt de hanging-dropmethode gebruikt om organoïden te creëren voor gebruik in het microfluïdische apparaat. Deze methode maakt de vorming van consistente organoïden in een korte periode mogelijk. Het in vitro testen van chemotherapeutische geneesmiddelen in driedimensionaal weefsel kan helpen bij het efficiënter screenen van geneesmiddelen in vergelijking met monolagen van cellen.

Meng de PDMS en het uithardingsmiddel van het siliconen elastomeer in een gewichtsverhouding van negen op één. Giet dit mengsel vervolgens over de master om een vier millimeter dikke laag te vormen. Ontgas om luchtbellen te verwijderen en hard uit bij 60 °C gedurende vijf uur.

Pel het uitgeharde PDMS van de mal om een stempel van stroomkenmerken op het elastomeer te verkrijgen. Gebruik vervolgens een biopsietpons van anderhalf millimeter gemonteerd op een boor om gaten te ponsen voor de in- en uitlaten. Verwijder alle resten.

Behandel de functionele zijde van de stempel en een schoon glazen objectglas acht minuten lang met zuurstofplasma. Breng de behandelde oppervlakken in een zuurstofplasma-etcher onmiddellijk met elkaar in contact om een verbinding tussen beide te vormen. Houd de assemblage gedurende ten minste vijf uur op 60 °C op een objectglasverwarmer.

Om de verbinding te versterken, sluit PTFE-buisjes met een binnenste diameter (ID) van 0,032 inches aan op de in- en uitlaten van het microfluidische apparaat. Er wordt gebruikgemaakt van een interface van mannelijke lure-lock-connectoren die zijn bevestigd aan geribbelde vrouwelijke lure-lock-connectoren; deze specifieke connectoren worden gebruikt om doorgeven mogelijk te maken zonder dat er breuk ontstaat. Stel vervolgens de flow-assemblage samen met behulp van afsluiters en een Y-connector, en monteer het apparaat op de microscoop. Sluit na montage van het apparaat de buisjes aan op de juiste in- en uitlaten om de flow-opstelling te voltooien.

Zoals in deze figuur wordt getoond, maakt deze configuratie het eenvoudig en veelzijdig mogelijk om een sferoïde in het device te plaatsen of een stroom medium door het device te creëren om te laden. Open de vulinlaatklep VPN en de vuluitlaatklep VP uit. Een tumor-OID kan vervolgens via de inlaat naar binnen stromen en in de kweekkamer terechtkomen, waar de post in deze kamer de tumor op zijn plaats houdt tijdens de doorstroming van het medium.

Sluit de vulkleppen en open de toevoerklep VF in en de afvoerklep VF out om de vorming van uniforme PHE te initiëren. Gebruik de hanging drop-methode om trypsin-ijscellen onder een cultuurkap te verwerken. Neem de resulterende trypsin-cellen uit de centrifuge.

Verdun de stamoplossing tot de gewenste concentratie aan de hand van tabel één. Verwijder vervolgens de afdekking van een 48-well plaat en plaats deze ondersteboven. Vul in een steriele laminaire flowkast elke well van de plaat met één milliliter gesteriliseerd water.

Om de vochtigheid te behouden, plaatst u een druppel van 20 µL van de verdunde cellenoplossing in elk cirkelvormig gebied op de afdekplaat. Keer de afdekplaat met een micropipet voorzichtig om en plaats deze op de plaat, waarbij u erop let dat de druppels de randen van de wells niet raken. Incubeer de plaat bij 37 °C.

Raadpleeg tabel één voor de incubatieduur op basis van de gebruikte specifieke cellen; in elke hangende druppel zal een steroïde worden gevormd. Begin met het steriliseren van het apparaat door 70% ethanol via de stroomingang door te spoelen. Volg dit met een spoeling van PBS en vervolgens HEPES-gebufferd celkweekmedium.

Laat de spuit met medium staan en bevestig deze aan de slang. Trek vervolgens twee tot drie Steroids op in de spuit. Om luchtbellen te verwijderen, bevestigt u de spuit aan de pakkinginlaat van het apparaat.

Open de inlaatklep VPN en sluit VFN, open de uitlaatklep VP out en sluit VF out. Houd de vulspuit verticaal met de naald naar beneden gericht. Wacht tot het steroid naar de bodem van de spuit zakt, in de luer-lock connector van de naald.

Druk op de zuiger van de vulspuit en observeer hoe PHE de slang binnengaat en in het apparaat stroomt, aangezien alleen de uitlaatklep voor het vullen openstaat. Een steroïde zal de kamer van het apparaat binnengaan en worden vastgehouden door pinnen aan de achterzijde. Eenmaal in de kamer neemt de S-sferoïde de vorm van de kamer aan en krijgt deze een rechthoekige geometrie.

Sluit de inlaatklep VPN en de uitlaatklep VP out en monteer de flowspuit SF op de spuitpomp. Deze pomp wordt door een computer aangestuurd met behulp van syringe pump pro; open de inlaatklep VFN en de uitlaatklep VF out. Start de stroom van medium in het apparaat met 3 µL per minuut.

Incubatie van de sferoïde gedurende 24 uur wordt gevolgd door de toevoeging van agentia voor de detectie van apoptose. Laat de sferoïde vóór de toevoeging van detectie- of therapeutische agentia voor apoptose tot 24 uur equilibreren om nutriëntgradiënten en micro-omgevingen te laten ontstaan. Sluit vervolgens klep VFN.

Stop de spuitpomp. Verwijder de spuit uit de pomp en vervang deze door de spuit die medium bevat met 0,25 µL/ml CASPglow red actieve Caspase-3-marker. Spoel het apparaat met de oplossing door handmatig 0,7 mL hiervan door het apparaat te spoelen.

Bevestig vervolgens de spuit op de pomp. Start de vloeistofstroom opnieuw en open klep VFN. Gedurende een periode van vijf tot acht uur zal cask glove red active cph phase three diffunderen in het weefsel en feller fluoresceren in apoptotische regio's. Het apoptose-detectiemiddel in deze concentratie wordt gehandhaafd in alle daaropvolgende stroomoplossingen.

Doxorubicine wordt vijf tot acht uur na de toevoeging van de middelen voor de detectie van apoptose geïntroduceerd. Deze behandeling wordt uit het systeem gespoeld. Om chemotherapeutische middelen toe te voegen, dient de procedure voor apoptosedetectie te worden gevolgd om 10 micromol doxorubicinehydrochloride toe te dienen.

Vervang vervolgens de behandelspuit door de spuit met 0,7 milliliters medium. Laat de therapeutische stof gedurende een vaste periode doorstromen. Sluit daarna ventiel VFN en schakel de spuitenpomp uit.

Verwijder de behandelspuit uit de spuitpomp en vervang deze door een spuit met 0,7 milliliters medium. Laat het verse medium gedurende 24 tot 36 uur doorstromen, terwijl het weefsel continu onder een microscoop wordt gemonitord. Het gehele acquisitieproces voor time-lapse microscopie werd geautomatiseerd met behulp van een aangepast script in IP lab, waarbij elke 30 minuten doorgeಲ್ಲen licht- en fluorescentiebeelden van de PAX Foid werden gemaakt bij een 10 x vergroting. Voor de wiskundige schatting van de diffusiecoëfficiënten van het geneesmiddel is de eerste stap het genereren van gemiddelde lineaire intensiteitsprofielen van de fluorescentie van het medicijn met behulp van Image J. Selecteer een rechthoekig interessegebied, of ROI, dat het weefsel in de kamer omvat.

Gebruik het commando plot profile om een profiel van de gemiddelde intensiteiten te genereren als functie van de afstand tot het stroomkanaal. Herhaal dit voor maximaal drie verschillende tijdspunten. Trek vervolgens de gemiddelde achtergrondfluorescentie-intensiteit af van de verkregen intensiteitsprofielen en normaliseer elk profiel met behulp van de overeenkomstige maximale intensiteit om C als functie van X en T te verkrijgen. Hierbij is C de genormaliseerde concentratie doxorubicine, waarbij de waarde van C varieert tussen nul en één.

De volgende stap is het evalueren van de effectieve diffusiecoëfficiënt van doxorubicine binnen het tumorweefsel. Diffusie kan worden weergegeven door de volgende vergelijking, waarbij ERFC de complementaire foutfunctie is. X is de afstand in het weefsel vanaf het kanaal, en T is de tijd na de toediening van doxorubicine.

Gebruik het volgende iteratieve schema voor elk overwogen tijdstip. Schat een waarde voor D. Bereken de rechterkant van de vergelijking op elke locatie X. Bereken de som van de kwadratische fouten tussen de twee kanten en pas D aan om het gemiddelde residu te minimaliseren.

De optimale waarden van D die op elk tijdstip zijn verkregen om de gemiddelde effectieve diffusiecoëfficiënt van doxorubicine in het weefsel te schatten. De microfluïdische apparaten boden optisch toegankelijke kweekkamers van één millimeter bij 0,3 millimeter bij 0,15 millimeter voor de groei van driedimensionaal tumorweefsel. De hanging-dropmethode maakte een snelle vorming mogelijk van tumor-PHE van consistente grootte en vorm uit verschillende cellijnen.

PHE werden met succes gedurende maximaal drie dagen op het apparaat gekweekt. Groei in de kamers was geassocieerd met de reproduceerbare modificatie van micro-omgevingen. Binnen de PHE trad apoptose minder vaak op in cellen in directe nabijheid van het stroomkanaal en vaker en dieper in het weefsel.

Het apparaat werd gebruikt om de diffusiecoëfficiënt van doxorubicine en tumorweefsel te schatten. De experimenteel verkregen waarde kwam overeen met de waarde die eerder werd gerapporteerd voor menselijke borstkanker. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om extra voorzichtig te zijn met het behouden van steriliteit bij het inbrengen van PHE in het apparaat, aangezien dit buiten de celkweek moet gebeuren.

Besproei de spuiten in de zuurkast en de uiteinden van de slangen ruim met ethanol om steriliteit te waarborgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de rol van de beperkte penetratie van geneesmiddelen in tumoren. We hebben een techniek gedemonstreerd om de afgifte en systemische klaring van geneesmiddelen in driedimensionale tumorweefsels na te bootsen en hun penetratie te kwantificeren.

Het elimineren van geneesmiddelen met een slechte penetratie zal het proces van de ontwikkeling van kanker-geneesmiddelen aanzienlijk stroomlijnen.