Postsynaptische Recordings op Afferente Dendrieten Contact opnemen met Cochlear binnenste haarcellen: Monitoring multivesiculaire release op een lint Synapse

Het algemene doel van deze procedure is het registreren van postsynaptische activiteit bij afferente synapsen van binnenste haarcellen. Dit wordt bereikt door eerst het sensorische epitheel van een slakkenhuis bloot te leggen, dat onlangs is verwijderd uit een gedecapiteerde rat. De tweede stap van de procedure is het positioneren van de uitgesneden apikale wind op een aangepast dekglas en het overbrengen hiervan naar de registratiekamer.

De derde stap van de procedure is het lokaliseren en verkrijgen van toegang tot een afferent axon met een registratie-elektrode. De laatste stap van de procedure is het vormen van een nauwe afsluiting (seal) op het membraan van de afferente vezel en dit vervolgens doorbreken om de whole-cell configuratie van de patchclamp-techniek te vestigen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die postsynaptische gebeurtenissen of potentialen van een enkele ribbon-synaps aantonen via whole-cell patchclamp-elektrofysiologie.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de dissectie en preparatie van cochleair weefsel moeilijk te leren zijn en de kleine afferente vezels lastig te herkennen en te bereiken zijn. Bereid vóór aanvang van de dissectie een aangepast dekglas voor dat het preparaat tijdens de opnames op zijn plaats houdt. Breng, met behulp van een circulair glazen dekglas van 8 tot 12 millimeter, een druppel half uitgeharde Sylgard aan nabij de rand van het dekglas.

Plaats het dikke uiteinde van een fijne insectennaald op het dekglas. Houd de insectennaald stevig tegen het glas aan. Verhit met een pincet de sill guard tegen een verhitte spoel om deze te fixeren.

Bereid 10 tot 20 micro-elektroden voor zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Na vuurpolijsten met een micro-smedekachel moet de micro-elektrode een buitenste tipdiameter van ongeveer één micron hebben. De uiteindelijke dikte van de pipettewand is ongeveer één derde van een micrometer na anesthesie en onthoofding van een drie weken oude rat.

Begin de dissectie door de huid te verwijderen, de kop te dissekeren en de hersenen te verwijderen. Verwijder beide temporale beenderen om het slaapbeen bloot te leggen. Plaats elk temporaal beender in een schone dissectieschaal met standaard extracellulaire oplossing. De volgende stap is het verwijderen van het bot dat het temporale beender omhult, om zo de cochlea bloot te leggen.

Houd het slaapbeen stevig vast bij de basis met een pincet. Identificeer het ronde en ovale venster en de cochlea. Orienteer de cochlea zodanig dat het ovale venster en de spiraalvormige zijde van de cochlea naar boven zijn gericht.

Verwijder overtollig bot rondom het slakkenhuis. Gebruik een tweede set fijne pincetten om het bot direct van het slakkenhuis af te chippen, beginnend bij het gebied dat transparanter is dan de rest van het bot. Hier is het bot dunner en gemakkelijker te verwijderen.

Verwijder verder het bot rondom de apicale winding. Gebruik microsdissectiescharen om door de modiolus onder de apicale winding te knippen. Koppel vervolgens de apicale winding los van de lagere windingen van de cochlea.

Zorg ervoor dat de apicale winding wordt beschermd. Deze mag niet worden getrokken of uitgerekt. Verwijder tot slot de apicale winding uit het slakkenhuis zonder het weefsel te veel te scheuren.

Gebruik een fijne pincet om het resterende bot te verwijderen. De volgende stap is het verwijderen van de STR of oculis en het tial membraan. Verwijder voorzichtig de STR of oculis, de glanzende strook weefsel die zich buiten het gebied van de haarcellen bevindt.

Zorg ervoor dat de sensorische haarcellen niet worden verwijderd, aangezien deze gemakkelijk kunnen loslaten samen met de STR van de oculis. Gebruik vervolgens een fijne pincet om het tial-membraan los te maken. Dit is het glanzende, semitransparante membraan dat zich boven de sensorische haarcellen bevindt. Trim nu het overtollige weefsel en bot weg en vlakt het preparaat af met de pincet.

Dit is noodzakelijk zodat het weefsel gelijkmatig onder een speld kan worden geplaatst. De dissectie is nu voltooid. Plaats het preparaat onder de speld op het voorbereide dekglas en zorg ervoor dat de speld, zodra de dissectie is voltooid, uit de buurt van de haarcellen wordt gepositioneerd.

Gebruik een pincet om het preparaat naar de meetkamer over te brengen, waarbij een druppel extracellulaire vloeistof op het dekglas met het cocleaire weefsel wordt behouden; begin onmiddellijk met perfusie met extracellulaire oplossing. Om een betere overleving van het preparaat te waarborgen, dient het 10 x objectief van de microscoop of het 40 x water-immersie DIC-objectief te worden gebruikt. Om het preparaat te lokaliseren, dient het preparaat zodanig te worden georiënteerd dat de registratie-elektroden de binnenste haarcellen in een rechte hoek ten opzichte van hun laterale wanden kunnen naderen.

Indien de zichtbaarheid van de basale regio van de binnenste haarcellen beperkt is doordat het preparaat is opgekruld, gebruik dan een registreerelektrode om de buitenrand van het preparaat tegen het glazen dekglas aan te drukken. Let er hierbij op dat u de binnenste haarcellen zelf niet indrukt. In dit preparaat houdt de bovenste elektrode de buitenrand van het preparaat naar beneden, terwijl de onderste elektrode aangeeft waar de afferente batons zich bevinden.

Ter referentie toont de NC 70 Nuv Con-camera het vergrote Forex-beeld op de monitor om vast te stellen of het weefsel in de regio van de binnenste haarcellen gezond is. Gebruik de haarbundels als referentiepunt en focus naar beneden om de kernen te vinden. Focus verder naar beneden richting de basis van de binnenste haarcellen met de afferente uiteinden en vervolgens weer omhoog tot het niveau van de kernen op de monitor is bereikt.

Zoek nu de afferente batons rond de basis van de binnenste haarcellen. De batons zijn sferisch of ellipsoïdaal, hebben een diameter van ongeveer één micron en zijn licht van kleur met een glanzend uiterlijk. U vindt ze door de focus omhoog en omlaag te verplaatsen.

De volgende stap is het vrijmaken van een pad naar de afferente vezels met behulp van een registreerelektrode met een punt van één micron, gevuld met intracellulaire vloeistof. Oefen een positieve druk uit en gebruik de micromanipulator om de elektrode naar het preparaat te manoeuvreren. Gebruik deze elektrode om een incisie in het preparaat te maken op het niveau van de basis van de binnenste haarcel.

Duw de elektrode met positieve druk tussen de dunne laag ondersteunende cellen en de binnenste haarcellen om een toegangsweg te creëren naar het gebied aan de basis van de binnenste haarcellen. Verwijder de elektrode voorzichtig en vervang deze door een nieuwe elektrode met een tip van één micron diameter, gevuld met intracellulaire oplossing. Beweeg de registreerelektrode, waarbij positieve druk wordt gebruikt om de elektrodetip schoon te houden, via het toegangsgat langs aangrenzende ondersteunende cellen in de richting van de afferente baton.

Zorg ervoor dat de elektrodepunt zich direct voor het afferente baton bevindt; batons bieden meer weerstand tegen de beweging van de pipet dan de ondersteunende cellen en het membraan van de binnenste haarcel. Dit verschil is voelbaar terwijl de pipet wordt bewogen; beweeg de pipet op en neer en duw om te bevestigen dat het baton beweegt. Dit geeft aan dat de pipetpunt en het baton zich in hetzelfde brandvlak bevinden, met de elektrode tegen het afferente baton gedrukt. Laat gelijktijdig de positieve druk los en pas zuigkracht toe om een giga-ohm seal te vormen.

Pas voorzichtig korte zuigpulsen toe om het membraan in de elektrode te laten scheuren voor een whole-cell opname. Indien de gepatchte cel een afferente baton is, worden kleine capacitieve transiënten waargenomen in de whole-cell opnamemodus. Deze figuur toont een typische transiënt geregistreerd van een afferente vezel.

Begin met het registreren van de synaptische activiteit. Als de afferente vezel geen spontane activiteit vertoont, depolariseer dan de haarcel door een extracellulaire oplossing met een hogere kaliumconcentratie toe te dienen. Deze figuur toont typische stroom-spanningsrelaties voor AFF-vezels links en binnenste haarcellen rechts.

De stroom-spanningsrelaties werden geregistreerd bij een rustpotentiaal van -84 millivolt met spanningsstappen van -124 millivolt tot +36 millivolt in stappen van 10 millivolt. De spanningen worden rechts van enkele sporen weergegeven, waarbij de focus ligt op de stroom-spanningsrelaties van een afferente vezel. Let op dat de excitatoire postsynaptische stromen of EPC's aanwezig zijn tijdens de meeste spanningsstappen.

De EPC's keerden om bij ongeveer plus zes millivolt. Deze registratie werd uitgevoerd in aanwezigheid van tetrodotoxine om spanningsafhankelijke natriumstromen te blokkeren; zonder deze blokker zouden er aanvullend snel activerende binnenwaartse natriumstromen in de registratie zijn verschenen, wat de registratie zou hebben geïdentificeerd als een registratie van een afferente vezel. Let op de langzaam activerende binnenwaartse stroom bij hyperpolariserende spanningen.

Deze stroom is niet aanwezig in binnenste haarcellen of ondersteunende cellen en vormt een goede indicatie dat de opname afkomstig is van een afferente vezel. Deze opnamen tonen de stroom-spanningsrelaties voor een binnenste haarcel. De pijl wijst naar de snel activerende uitwaartse kaliumstromen bij positieve potentialen.

Deze worden gevolgd door vertraagde gelijkrichter-kaliumstromen als gevolg van een kleine pipetdiameter en een hoge toegangsweerstand. De hier getoonde stromen van de binnenste haarcellen zijn kleiner dan verwacht om nauwkeurige registraties van binnenste haarcelstromen te verkrijgen. Pipetten met lagere toegangsweerstanden zouden gebruikt moeten worden.

De hier gepresenteerde opnames tonen echter aan dat de stroom-spanningsrelaties van binnenste haarcellen en afferente vezels duidelijk van elkaar kunnen worden onderscheiden. Deze figuur toont synaptische stromen gemeten vanuit een afferente vezel. Let op de variabele grootte en vorm van de EPC's.

De opnames werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, waarbij tetrodotoxine werd toegepast om de spanningsafhankelijke natriumstromen te blokkeren. Deze figuur toont gelijktijdige opnames van een binnenste haarcel en een contacterende afferente baton. Er werd een voltagesprong gebruikt om de binnenste haarcel te depolariseren, waarop binnenwaartse calciumstromen in de binnenste haarcel werden geregistreerd; de calciuminstroom resulteert in de afgifte van neurotransmitters en activeert EPC's in de afferente baton.

Let op de synaptische depressie die optreedt tijdens een depolarisatie van 50 milliseconde van de binnenste haarcellen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Het is belangrijk om zorgvuldig te zijn bij het dissekeren en prepareren van cochleair weefsel en om geduldig en optimistisch te blijven bij het proberen te registreren van afferente terminalen.