Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van cellulase-expresserende klonen uit een metagenomische bibliotheek. Dit wordt bereikt door eerst een eerder gemaakte metagenomische bibliotheek te repliceren met behulp van een robot, gevolgd door incubatie van de gerepliceerde bibliotheek bij 37 °C gedurende 24 uur. De groei van de E. coli-klonen wordt gemeten, waarna lysisbuffer en substraat aan de gerepliceerde bibliotheek worden toegevoegd.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die cellulase-activiteit aantonen via colorimetrische absorbantiemetingen met gebruik van een platenlezer. Hallo, ik ben Keith uit het laboratorium van Steven Hallam van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of British Columbia. Vandaag laten we u een procedure zien voor de high-throughput functionele screening van metagenomische bibliotheken.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de cellulase-activiteit van biomin te bestuderen vanuit metagenomische bibliotheken. Laten we beginnen. Bereid vóór de start van dit protocol een metagenomische bibliotheek voor die is opgeslagen in een 384-wells plaatformaat.

Voor deze studie werd de PCC one copy control SMID-vector gebruikt in combinatie met Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant e coli-cellen als library-gastheer. Om deze procedure te starten, worden de platen met de bibliotheek verwijderd uit -80 °C en ongeveer 20 minuten ontdooid bij 37 °C. Gebruik ondertussen de UV-lichtsterilisatiefunctie van de QIX two om de robot gedurende 15 minuten te steriliseren. Stel de Q fill three in volgens de instructies van de fabrikant, waarbij de mediumfles via de steriele slangverbinding aan het manifold is bevestigd.

Vul de Q fill three met de juiste hoeveelheid medium en stel deze in om een volume van 45 µL te vullen. Verwijder in elke put de lucht uit de slang en het verdeelstuk met de spoelfunctie van de robot totdat het medium zichtbaar is. Vul bij elke pin van het verdeelstuk het gewenste aantal platen met LB-medium met behulp van de Q fill three.

Elke plaat doet er ongeveer 20 seconden over om te vullen. Laad vervolgens de bibliotheekplaten en de nieuwe platen in de juiste gebieden van de Q picks. Laat de robot de reinigingsbaden vullen met de juiste reagentia.

2% Micro 90 in het achterste bad, autoclave gedestilleerd water in het middelste bad en 80% ethanol in het voorste bad. Selecteer met het replicatieprogramma van de Qix Two de juiste kop, evenals het aantal en de typen van zowel de bron- als de doelplaten. Stel de kop daarnaast zo in dat deze tussen de replicaties wordt gereinigd.

Meestal zijn zes cycli per bad voldoende. De capaciteit van de machine is 10 platen tegelijk. Zet de machine aan.

Het repliceren duurt ongeveer 15 minuten. Volledige capaciteit met een 384-pins kop. Zodra de platen zijn gerepliceerd, worden deze gedurende 24 uur bij 37 °C gekweekt in een bevochtigingsbox.

De lange incubatietijd is noodzakelijk aangezien er door de toevoeging van arabinose een hoog kopiegetal van smid wordt geïnduceerd. Reinig ondertussen de Q fill three robot zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Verwijder na de incubatie de platen uit de incubator van 37 °C.

Leg de deksels apart en plaats de platen op het magazijnlaadplatform dat bij de rapid stack wordt geleverd. Houd de volgorde van de platen goed bij, aangezien de software dit niet doet. De platen onderaan de stapel zullen als eerste worden uitgelezen.

Verwijder eerst één magazijn uit de snelle stapel. Controleer of het leeg is en schuif het op de stapel platen die gelezen moeten worden. Pak het magazijn bij het handvat, waarna de plaat in het magazijn geladen wordt.

Plaats het magazijn in de juiste oriëntatie in de rapid stack. Open het scan its re-programma op de aangesloten computer. Selecteer een nieuwe sessie en geef deze een passende naam.

Selecteer de vlakbodem 384-wellplaat als de plaat. Typ in het gebied voor de plaatindeling. Selecteer de wizard-knop en kies deze om 384 onbekenden aan de plaat toe te voegen.

Selecteer in het protocolgebied de optie well loop en voer 384 wells in. Er verschijnt een well loop-pictogram in de flow tree aan de linkerkant van het scherm. Selecteer het pictogram en klik om een fotometrische meting toe te voegen.

Stel het in om te lezen bij 600 nanometers. Sla het protocol op onder een unieke naam en sluit het scan-reprogramma. Open vervolgens het Polara RS-programma.

Op de hoofdpagina staat een tabel met de instrumenten die zijn aangesloten op het rapid stack-apparaat; klik onder de kop VARI scan op de optie run session. Het assay-venster verschijnt vervolgens met een stroomdiagram in het midden. Selecteer het item run session en zoek daarna de naam van de opgeslagen scan.

Gebruik de optie 'run' in het vervolgkeuzemenu dat aan de rechterkant van het scherm verschijnt. Zodra het protocol is geselecteerd, klikt u op 'run'. Er verschijnt een venster waarin wordt gevraagd welk magazine als bron moet worden gebruikt en welk magazine leeg is.

Het onderste vak op het scherm komt overeen met het voorste magazijn. Zorg ervoor dat zowel de rapid stack als de Vario scan zijn ingeschakeld en klik op start. De rapid stack zal de platen automatisch in de platenlezer laden, waardoor continue metingen van de platen mogelijk zijn.

Observeer het laden van de eerste plaat in de Vario scan om ervoor te zorgen dat de machines correct zijn uitgelijnd voor het uitlezen. 25 platen duren ongeveer 50 minuten. Zodra de scan is voltooid, verwijdert u het volle magazijn en plaatst u dit op het laadplatform voor het magazijn.

Til de buitenste rechthoek van het platform op, zodat het magazijn eraf schuift en de platen in een stapel in het midden blijven staan. Plaats tot slot de deksels terug op de platen voor een screening op basis van oplossingen. Bereid voor de cellulose-activiteit eerst het assay-mengsel voor met behulp van een vooraf gemaakte 10 keer stock van lysis.

Meng dit in 50 millimolair kaliumacetaatbuffer bij pH 5.5 zoals beschreven in het geschreven protocol. Bereid vervolgens een voorraadoplossing van maximaal 75 milligram per milliliter chromogeen DIPHENYL of DNP celbiocide-substraat in DMSO, waarbij u ervoor zorgt dat het substraat volledig is opgelost. Voeg de DNP celbiocide-voorraadoplossing toe aan het assaymengsel tot een eindconcentratie van 0.1 milligram per milliliter.

Houd er rekening mee dat elke plaat ongeveer 20 milliliter oplossing verbruikt en dat er een extra 50 milliliter nodig is om rekening te houden met het dode volume. Stel de Q fill three in zoals eerder beschreven om het assay-mengsel op elke plaat aan te brengen met behulp van de Q fill three. Het vullen van elke plaat duurt ongeveer 20 seconden.

Zodra het assay-mengsel is toegevoegd, worden de platen gedurende 12 tot 16 uur geïncubeerd bij 37 °C. Haal de platen in een bevochtigingsbox uit de incubator van 37 °C. Leg de deksels apart en plaats de platen op de magazine-laadplatform van de rapid stack op dezelfde wijze als voorheen.

Open het scan-its re-programma en stel het in zoals eerder gedaan, met uitzondering van de fotometrische meting, die moet worden ingesteld om te lezen bij 400 nanometer. Voer vervolgens de parameters in het POLARA RS-programma in, zoals eerder gedemonstreerd.

Laat de Vario scan de platen uitlezen. Verwijder en gooi de platen na afloop van de run weg. Om de absorbentiewaarden te exporteren, opent u de scan it re software en selecteert u.

Open een bestaand bestand. Selecteer de map waarin de sessie is opgeslagen en klik op het plus-icoon om de lijst uit te vouwen. Onder de kop 'Titel' staan opties met de labels container één tot container N. Afhankelijk van het aantal platen selecteert u in de menubalk bovenaan de pagina de eerste plaat die geanalyseerd moet worden en selecteert u vervolgens data report export.

Kies de opties voor export, zoals de platteindeling en de fotometrische gegevens. Klik op 'rapport bekijken' en vervolgens op 'bestand opslaan'. Kies de gewenste map.

Het uitvoerformaat is een Microsoft Excel-spreadsheet. Hierin staan de absorbantie-metingen van een enkele 384-wellplaat die een positieve kloon bevat, zoals getoond; positieve klonen vertonen een duidelijke toename in absorbantie vergeleken met klonen die geen cellulase-activiteit vertonen.

Verschillen in analysetijd, well-positie op de plaat of DNP-concentratie kunnen de absolute absorbantie-metingen beïnvloeden. Relatieve absorbantie-metingen, zoals het verschil in absorbantie ten opzichte van het plaatgemiddelde of het kolomgemiddelde, vormen een robuustere methode om cellulase-positieve klonen te identificeren. We hebben zojuist aangetoond hoe cellulase-positieve klonen uit een metagenomische bibliotheek kunnen worden geïdentificeerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u de DNP cell bio side moet oplossen in DMSO en uw platen moet incuberen in een bevochtigingskamer. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.