Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van bacteriële biofilms onder lage of matige schuifkracht met behulp van een drip flow biofilm-reactor of een roterende schijfreactor. Coupons in de biofilm-reactoren worden eerst geïnoculeerd met bacteriën en geïncubeerd bij 37 °C om de bacteriële cellen de mogelijkheid te geven zich aan de groeioppervlakken te hechten. Zodra de cellen aan de coupons zijn gehecht, wordt een stroom groeimedium gestart die een schuifkracht produceert die tijdens de ontwikkeling van de biofilm inwerking treedt.

Rijpe biofilms kunnen vervolgens worden geoogst voor analyse en observatie van de biofilms. Scanningelektronenmicroscopie kan worden toegepast om de ultrastructuur van de geproduceerde biofilms te bepalen. Ik ben Blaze Balls.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals flowcellen, is dat een hoge biomassa-productie en meerdere identieke biofilms eenvoudig kunnen worden gerealiseerd. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Rachel Stevenson en Kelly Schwartz, een technicus en een promovendus uit mijn laboratorium. De drip flow biofilmreactor bestaat uit vier kamers met inlaatpoorten voor de toevoer van medium en uitlaatpoorten voor de afvoer van afval.

In elke kamer bevindt zich een verwijderbaar coupon waarop de biofilm groeit. Om de druppelstroom-biofilmreactor te assembleren, plaatst u de coupons in elke parallelle kamer en sluit u de kamerdeksels stevig. Autoclaveer de geassembleerde reactor samen met de toevoerslangen voor voedingsstoffen om het systeem vóór gebruik te steriliseren.

Autoclaveer daarnaast het biofilm-groeimedium om de gesteriliseerde drip-flow-reactor te inoculeren. Plaats het apparaat op een vlak oppervlak en klem de effluentleidingen af. Vul vervolgens elke kamer met 10 milliliters steriel groeimedium op basis van triptische soja-bouillon en voeg 100 microliters staphylococcus aureus toe.

Overnight-cultuur gekweekt in hetzelfde medium voor elke kamer afzonderlijk. Plaats de geïnoculeerde reactor gedurende 18 uur in een incubator bij 37 °C om de cellen de mogelijkheid te geven aan het couponoppervlak te hechten. Klem na de incubatie de effluentleiding af en plaats de reactor aseptisch op een houten blok met een helling van 10 graden.

Verbind de slang voor de vloeibare voedingsbodem met een fles die continue-flow voedingsbouillon bevat. Leid de slang door de pomp en ontlucht de slang door de pomp op volle snelheid te laten draaien. Zodra de slang is ontlucht, stop dan de pomp en bevestig 22 gauge naalden van één inch aan het uiteinde van elke slang.

Veeg de stop van de kamerinlaat schoon met een ethanoldoekje en doe dit aseptisch. Steek de naalden door de inlaatstop. Zet de pomp aan en laat het medium over de coupons druppelen.

Bij een stroomsnelheid van ongeveer 125 microliters per minuut moet het medium van de inlaatstop poort naar de uitlaatpoort naar beneden stromen. Laat de reactor gedurende drie dagen in continue stroom werken. Controleer de reactor af en toe op een goede afwatering.

De drainage wordt gecontroleerd door visuele inspectie van de kamers om er zeker van te zijn dat het medium niet in de kamers blijft staan. Als het medium zich ophoopt, kan het dichtknijpen van de uitstroomslang meestal een goede drainage bevorderen om de biofilms te oogsten; stop de pomp en verwijder de naalden uit de reactor. Plaats de reactor vervolgens op een vlak oppervlak.

Na drie dagen continue doorstroming verschijnen Staphylococcus aureus-biofilms als gele biomassa die over de lengte van de geinoculeerde coupons is verspreid. Een scanning elektronenmicroscoopopname van de biofilm laat zien dat Staphylococcus aureus de coupon bedekt in een oppervlakte-geassocieerde biofilmgemeenschap. Om de verkregen biomassa te kwantificeren, worden de coupons met steriele pincetten zo aseptisch mogelijk verwijderd, worden de bacteriën geoogst met een celschraper en vervolgens overgebracht naar een conische buis met vijf milliliters steriele PBS.

Gebruik een weefselhomogenisator om de bacteriële klonten te desaggregeren tot er een uniforme suspensie is verkregen. Kolonievormende eenheden worden gekwantificeerd door seriële verdunningen uit te platen op triptisch soja-agarplaten, deze 24 uur bij 37 °C te incuberen en de koloniën te tellen. De roterende schijf biofilmreactor bestaat uit een chemostaat waardoor groeimedium wordt gepompt.

Een draaiende schijf met een stervormige stuurstang en 18 coupons die zijn ontworpen om in de draaiende schijf te passen. Om de reactor te assembleren, plaatst u eerst de coupons in de sleuven van de draaiende schijf. Plaats vervolgens de geladen schijf in een glazen bekerglas van één liter met een overloopopening en sluit de reactor af met een rubberen stop nummer 15 met één gat voor de mediastroom en één gat voor beluchting.

Autoclaveer de gemonteerde reactor en de toevoerleidingen om het systeem te steriliseren. Om de reactor te inoculeren, vult u het bekerglas met 250 milliliters steriel cultuurmedium en voegt u 500 microliters toe van een overnight-cultuur van staphylococcus aureus gekweekt in triptych soy broth. Plaats de reactor op een roerplaat ingesteld op 250 rotations per minute en incubeer deze overnight bij 37 degrees Celsius om de cellen op de coupons te laten hechten.

Sluit na de incubatie gedurende de nacht de inlaatslang aan op de poort van het mediumreservoir en op de peristaltische pomp. Zet de pomp aan en stel de stroomsnelheid in op 0,25 milliliters per minuut. Laat de reactor 24 uur lang draaien bij 37 graden Celsius om de resulterende biofilms te oogsten.

Stop de reactor en werk aseptisch. Verwijder de schijf zonder de coupons aan te raken. Verwijder de coupons met een steriele pincet en dip elke coupon voorzichtig in steriele PBS om losjes gebonden bacteriën te verwijderen voor het testen van antimicrobiële verbindingen.

Plaats de coupons aseptisch in afzonderlijke wells van een 96-wells plaat die de betreffende verbindingen bevat. Incubeer de plaat vier uur bij 37 °C. Draag de coupons vervolgens over naar 1,5 mL microcentrifugebuisjes met 1× PBS en disperseer de biofilms met behulp van een homogenisator.

Plat tenslotte seriële verdunningen van de cellen uit op nutriëntenagarmedium om het aantal levensvatbare colony forming units per monster te bepalen, zoals eerder beschreven. Deze grafiek toont het aantal colony forming units in biofilms die zijn geprepareerd met de spinning disc reactor en zijn blootgesteld aan waterstofperoxide, wat de mogelijkheid aantoont om tot 18 identieke biofilms te produceren. Door gebruik te maken van de spinning disc reactor is deze techniek bij uitstek geschikt voor het testen van antimicrobiële verbindingen.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van het runnen van biofilms in drip flow- en roterende schijfreactoren. Deze biofilmreactoren bieden alternatieven voor biofilms in flow-cellen en microtiterplaten en zijn ideaal wanneer een grote hoeveelheid biofilmbio-massa nodig is of wanneer antimicrobiële testen op gevestigde biofilms gewenst zijn.