Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

Het algemene doel van het volgende experiment is om de overleving en verspreiding van methicilline-resistente Staphylococcus aureus of MRSA te onderzoeken, evenals de chemokine- en cytokineniveaus op de infectieplaatsen. Dit wordt bereikt door de vacht op de ruggen van muizen te verwijderen om een duidelijk observatiegebied te creëren. Als tweede stap.

MRSA in een suspensie wordt drie dagen na infectie subcutaan aan muizen toegediend; infectiepathologieën en bacteriële aantallen kunnen worden beoordeeld door het aantal colony forming units uit weefselhomogenaten op agarplaten te bepalen. Hallo, hoe gaat het met u? Mijn naam is De Lordon.

Ik ben een postdoctoraal onderzoeker. Hallo, mijn naam is Mariel Sanchez. Ik ben een PhD-student en ik ben Andrea Huda.

Ik ben een onderzoeksmedewerker en we maken deel uit van het laboratorium van George Lee in de afdeling pediatrie van het Cedar-Sinai Medical Center. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het medische veld, zoals de modellering van ernstige infecties, waaronder myositis, polymyositis en necrotiserende fascitis. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in ernstige acute infecties, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals groep A streptokokken en andere organismen.

Daarnaast kunnen we de functie en pathogenese bestuderen van andere organismen die myositis en polymyositis veroorzaken. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze procedure moeite hebben, omdat een van de medewerkers van caucusgebieden globale regulator zeer muteerbaar is. Als er geen voorzorgsmaatregelen worden genomen, kunnen de verzamelde gegevens een aanzienlijke variatie vertonen, wat ertoe zal leiden dat de gegevens moeilijk te interpreteren zijn.

Laten we beginnen. Bereid in een BSL-2 faciliteit een schapenbloedagarplaat in TSA-basis en een steriele lus met behulp van een vriesblok voor. Haal de Mercer-stammencultuur uit de opslag bij -80 °C.

Breek vervolgens met de steriele loot een klein ijsfragment van de stockcultuur af op de plaat. Plaats de stockcultuur direct nadat er een klein fragment van de Mercer-stockcultuur is verkregen terug in de vriezer om ontdooiing te voorkomen, aangezien herhaaldelijk vriezen en ontdooien de stockcultuur beschadigt. Gebruik de loot om de agar uit te strijken om de groei van individuele Mercer-kolonies te faciliteren.

Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 37 °C zonder CO2-toevoeging. Bereid de volgende dag een nieuwe blood agar-plaat, een TSA-plaat en een snap-cap buis van 15 ml met 3 ml THB voor en label deze.

Haal de overnight gecultiveerde M SSA-plaat uit de incubator en onderzoek het hemolytisch fenotype van de kolonies. Kies met een steriele lus een kolonie die een fenotype heeft dat consistent is met eerdere experimentele kolonies. Inoculeer het THB met de geselecteerde kolonie met behulp van dezelfde lusstreekmethode.

Incubeer de THB-oplossing op de plaat gedurende de nacht bij 37 °C met schudden op 220 toeren per minuut. Deze bacteriën zullen worden gebruikt om de cultuur te inoculeren voor subcutane infectie van de muizen in latere stappen. Plaats de bloedagarplaat eveneens in de incubator.

De plaat wordt de volgende ochtend gebruikt om te bevestigen dat het hemolytisch fenotype van de bacteriën in de THB-oplossing overeenkomt met dat van de oorspronkelijk geselecteerde kolonie. Als het hemolysefenotype niet consistent is met de oorspronkelijke kloon, mag het experiment niet worden gestart. Plaats de muis op een platform en scheer de vacht op de rug.

Als het dier overmatig agressief is, kan sedatie met isofluraan noodzakelijk zijn. Breng ongeveer vijf kubieke millimeter ontharingscrème, zoals NA, aan op het geschoren gebied. NA kan worden gekocht bij de lokale drogist.

Zorg ervoor dat u de ontharingscrème met babyolie aanschaft, omdat het product zonder babyolie te stimulerend zal zijn voor de muizen. Laat de crème ongeveer één minuut inwerken op het huidoppervlak; terwijl de ontharingscrème inwerkt, maakt u een paar papieren handdoeken nat met dubbel gedestilleerd water. Gebruik de natte papieren handdoeken om het geschoren gebied schoon te vegen.

Zorg ervoor dat de huid vrij is van de ontharingscrème. Voorverwarm 10 milliliters THB in een 50 milliliter schroefdopbuisje bij 37 °C in een bacteriële incubator gedurende vier tot 10 uur. Breng 20 µL van de overnight bacteriecultuur over naar de voorverwarmde THB. Dit zal de overnight merc verdunnen.

Een suspensie op 1:500. Plaats de buis bij 37 °C in een schudincubator op 220 rpm gedurende ongeveer tweeënhalve tot drie uur. Gebruik meer THB om de bacteriële suspensie verder te verdunnen tot 1:10 en meet de suspensie met een spectrofotometer.

Met absorptie bij 514 nanometer. Blijf de suspensie incuberen bij 37 °C met schudden op 220 toeren per minuut totdat de 1:10 verdunde suspensie 0,25 bereikt. Om de cellen te verzamelen, centrifugeer de 50 milliliter buis bij 3.225 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant en resuspendeer.

Suspendeer de bacteriële pellet in 10 milliliter DPBS en was de bacteriën opnieuw door de centrifugatiestap te herhalen voor dit ernstige infectiemodel. Resuspendeer de bacteriële pellet in ongeveer één milliliter DPBS, resulterend in ongeveer 1 × 10¹⁰ colony forming units per milliliter. Bereid schapenbloed A-R-T-S-A platen voor en verdun de bacteriën serieel van 10¹ tot 10⁸ in DPBS op de platen.

Pipetteer druppels van 10 µL van de serieel verdunde bacteriële suspensie in triplo op een bloedagarplaat. Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 °C. Observeer en noteer na een incubatietijd van 16 tot 18 uur het hemolysefenotype van het inoculuum.

Tel de colony forming units op de platen. De infectieuze dosis van het inoculum wordt berekend op basis van het aantal colony forming units op de platen.

Bereid een spuit voor met 100 µL van de eerder bereide bacteriële suspensie in DPBS. Vóór de injectie moeten de muizen gesedeerd worden zodat hun ademhalingssnelheid ongeveer één keer per seconde is. Ter demonstratie wordt in deze video een geëuthanaseerde muis getoond.

Injecteer het M serum in één flank na de injectie. Plaats de muis terug in de kooi. Observeer de dieren gedurende drie tot vijf uur na de injectie om er zeker van te zijn dat de muis in leven is voordat deze wordt teruggebracht naar de dierruimte.

Controleer de laesies op de ruggen van de dieren dagelijks nadat de dieren zijn geofferd. Meet en noteer de grootte en de conditie van de laesies op de huid. Zowel de laesiegebieden op de huid als in de spieren worden gekwantificeerd door de lengte en breedte van de laesie in millimeters met elkaar te vermenigvuldigen.

Onregelmatig gevormde laesies moeten worden opgedeeld in kleinere symmetrische stukken, waarbij elk stuk met dezelfde methode wordt gemeten. Bereid 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes voor met 100 microliters DPBS voor de weefselverzameling. Maak een sneetje in de huid met een steriel scheermesje en excideer de laesie met een steriele schaar.

Zorg er bij het excideren van de laesie voor dat er ook ongeveer twee tot vijf millimeter gezond weefsel rondom het gebied wordt weggenomen. Plaats de laesie in de weefselopvangbuisjes voor het analyseren van de spierlaesies. Pel de huid voorzichtig af om de grootte te meten en de conditie van de laesie op het spierweefsel te registreren.

Verzamel de milt en de nieren. Plaats deze weefsels in hun eigen individuele collectiebuisjes. Homogeniseer de weefsels door ongeveer 30 seconden lang te agiteren met een spuit van één milliliter.

Voeg 900 µL DPBS toe aan elke buis. Stel de THA-platen samen en vortex de gehomogeniseerde weefselmonsters gedurende vijf minuten. Verdun het monster serieel.

Maak suspensies van 1 tot 10⁶. Breng in 96-wells platen 10 µL van elke serieel verdunde suspensie over op de platen. Incubeer de platen gedurende de nacht in een bacteriële incubator bij 37 °C.

Tel de volgende ochtend de colony forming units op de platen en bereken het aantal colony forming units op basis van de verdunningsfactoren. Als de infectie correct is uitgevoerd, zal er onmiddellijk na de subcutane injectie een blep op het huidoppervlak waarneembaar zijn. Indien er geen blep wordt waargenomen, kan de injectie te diep zijn, wat de uitkomst van de infectie kan beïnvloeden.

De grootte van de laesies en het bacteriële overleven kunnen op verschillende tijdstippen na infectie met MSA worden beoordeeld. De volgende huidlaesies werden onderzocht op dag drie na de infectie en zijn voorbeelden van een laesie bij een CD1-muis die aan één flank is geïnfecteerd met 1 x 10⁷ colony forming units. Spierlaesies worden gewoonlijk aangetroffen in het weefsel onder de huidlaesies.

Hieronder volgen voorbeelden van de overeenkomstige spieroppervlaktelaesies bij de eerder getoonde foto's van huidlaesies. Dit zijn spierlaesies waargenomen op dag drie na infectie bij een muis die is geïnfecteerd met 1 × 10⁷ colony forming units. Het laesieoppervlak wordt bepaald als de lengte maal de breedte van de laesie, gemeten in millimeters, en kan worden gemeten om de weefselschade van de huid te beoordelen.

Het aantal colony forming units van de bacteriën die zich op de infectieplaats bevinden, kan worden gekwantificeerd in uitgesneden laesies. Het aantal colony forming units kan aangeven of een virulentiefactor de MSA een overlevingsvoordeel biedt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de standaard veiligheidsmaatregelen vanwege het gebruik van naalden en zeer pathogene microben tijdens deze procedure.

Ten slotte kan een inoculum dat 1.000 keer lager is dan in ons abcesmodel worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke S-factoren een persistente RSA-infectie bevorderen? Vergeet niet dat het werken met spuiten gevuld met Mars A extreem gevaarlijk kan zijn; neem voorzorgsmaatregelen zoals het direct weggooien van de spuit in de naaldencontainer om accidenteel prikken met de naald te voorkomen. Daarnaast is het voor dit experiment belangrijk om de standaard BSO2-protocollen te volgen om een juiste desinfectie van het werkgebied te waarborgen.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken. Hoi. Hoi, tot ziens.