RNA-interferentie in teken

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de techniek van RNA-interferentie in tekenen via injectie. Dit wordt bereikt door eerst dubbelstrengs RNA van het betreffende gen of de betreffende genen te synthetiseren. Vervolgens wordt het RNA in de tekenen geïnjecteerd, waarna ze gedurende 24 uur in een bevochtigingskamer worden gehouden.

Na deze rustperiode krijgen de teken de gelegenheid om te voeden op een dier, zoals een schaap. Voedingsparameters zoals gewicht, vervelling en eipositie, evenals de expressie van het doelgen of de doelgenen van belang via real-time R-T-P-C-R, worden bepaald. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het effect van het uitschakelen van doelgenen op de biologie van de teek aantonen door evaluatie van biologische parameters van de teek en genexpressie via real-time R-T-P-C-R.

Onze groep werkt met teken om moleculaire gebeurtenissen op het grensvlak tussen de teek en de pathogeen te karakteriseren, om deze basisinformatie vervolgens te gebruiken voor de ontwikkeling van methoden om tekenplagen en de overdracht van pathogenen naar mensen en dieren te beheersen. RNA-interferentie is een essentieel instrument in dit onderzoek geworden, omdat dit de enige beschikbare methode is voor genetische manipulatie van teken. De functie van veel tekengenen is nog onbekend.

RNA-interferentie stelt ons in staat om de rol van teken-genen en genexpressie te definiëren in vele aspecten van de biologie van de teek, waaronder paring, reproductie, voeding, spijsvertering, de functie van de speekselklieren en de vectorcompetentie van de teek voor de transmissie van pathogenen. De procedure zal worden gedemonstreerd door het team RNA-interferentie bij teken uit ons laboratorium: Dr. Ed Lewin, een promovendus, Busby en ikzelf. Om dubbelstrengs RNA te genereren, moeten eerst oligonucleotide-primers worden gesynthetiseerd die T7-promotersequenties bevatten voor in vitro transcriptie van RNA.

Bijvoorbeeld, derma center vari lesin. Gebruik de oligonucleotides primers D eight A a T 75 en D eight DVT 73 die hier worden getoond. Amplificeer het doelgen via RT-PCR met gebruik van 10 picomoles van elke oligonucleotide primer en 1 tot 10 nanogram totaal RNA van de teek.

Zuiver vervolgens het PCR-product. Gebruik daarna acht µL of ongeveer 100 ng om dubbelstrengs RNA te synthetiseren. Om de tekenen voor injectie voor te bereiden, worden deze eerst gewassen in de volgende reeks oplossingen: kraanwater, 3% waterstofperoxide, tweemaal gedestilleerd water, 70% ethanol en twee laatste wasbeurten met gedestilleerd water.

Voer elke wasbeurt uit in een wegwerpcentrifugebuis van 50 milliliter door te schudden. Decanteer vervolgens de oplossing door een fijnmazig draadgaasscherm. Dep de teken droog op papieren handdoeken en verdeel de teken vervolgens in groepen van 20 tot 50, afhankelijk van het experiment.

Plaats elke groep in een plastic bekertje van 1,25 ounce met een goed sluitend deksel en label elk bekertje met de experimentele groep. Stel vervolgens een RNAi-team samen bestaande uit drie personen die het injectieproces zullen uitvoeren. De eerste persoon positioneert elke teek op dubbelzijdige plakband dat is bevestigd op een vel rode tandheelkundige was van drie bij zes inch.

De tweede persoon injecteert de teken en de derde persoon monitort de teken na injectie, blaast koolstofdioxide op de teken om ze te activeren en telt en overbrengt de levende teken naar bekers die zijn gelabeld met het nummer van de experimentele groep. Alle teamleden moeten wegwerphandschoenen dragen. Om het injectieproces van de teken te starten, vangt u een teek met Dumont fijne pincetten en plaatst u deze met de ventrale zijde naar boven op dubbelzijdige plakband dat is bevestigd aan een vel rode dentale was. Positioneer de teken dicht bij elkaar in groepen van vijf. Plaats een klein stripje maskeringstape over de monddelen van alle vijf de teken.

Om ze verder te fixeren, laat u het grootste deel van het lichaam blootgesteld, zodat het injectieproces door de persoon die de teken injecteert kan worden geobserveerd. Om de teek te injecteren, prikt u een gaatje in het kwadrant rechtsonder van het ventrale oppervlak van het exoskelet met behulp van een mono-insulinespuit voorzien van een naald van 29 gauge en een halve inch. Injecteer vervolgens onmiddellijk 0,2 tot 0,5 µL dubbelstrengs RNA-oplossing in de teken met een op maat gemaakte Hamilton-spuit en een naald van 33 gauge en één inch met een schuin geslepen punt van 45 graden; plaats de naald diep in de holte van de teek om de plaatsing en retentie van het dubbelstrengs RNA te waarborgen.

Hoewel er na de injectie vloeistof vrijkomt, zorgt een diepe plaatsing van de injectienaald ervoor dat er voldoende dubbelstrengs RNA in de holte van de teek wordt afgezet om gen-silencing te veroorzaken; er moet erop worden gelet dat er niet te veel wordt geïnjecteerd. Het overinjecteren van de teken zal leiden tot verlies van hemolymfe en de dood van de teek. Pak de teken direct na het injecteren met de fijne pincet op van de dubbelzijdige plakband en plaats ze in een plastic herstelcontainer.

De teken zullen na de injectie kortstondig inactief blijven, maar zouden spoedig over het schaaltje moeten beginnen te kruipen. Activeer de teken door koolstofdioxide op hen uit te ademen. Zodra de teken kruipen en actief zijn, zal de injectiewond snel genezen en zullen ze waarschijnlijk overleven.

Tel de teken in elke experimentele groep en plaats elke groep in een gelabelde plastic beker met een nauwsluitend deksel. Vervang eventuele teken die in de huidige groep sterven voordat de volgende experimentele groep wordt geïnjecteerd. Reinig de Hamilton-spuit vóór het injecteren van de volgende experimentele groep door de spuit te vullen en vervolgens leeg te maken met verse 3% waterstofperoxide.

15 keer, gevolgd door 15 spoelingen met steriel water. Let erop dat u de zuiger van de Hamilton-spuit niet buigt, anders zal de zuiger niet soepel bewegen en niet reageren op de lichte aanraking die nodig is voor de injectie in de teek. Plaats de teken na de injectie in een kamer met een bak gevuld met water en kaliumsulfaat, wat gedurende één dag voor een hoge luchtvochtigheid zorgt en hen in stand houdt.

Plaats vervolgens individuele teken in tekenvoedingscellen die op een schaap zijn geplakt en laat ze voeden samen met een gelijk aantal niet-geïnjecteerde mannelijke of vrouwelijke teken, afhankelijk van welk geslacht niet is geïnjecteerd. Verzamel en weeg de vrouwelijke teken uit de voedingscel nadat ze ongeveer 10 dagen hebben gevoed of wanneer de controlevrouwtjes van de gastheer zijn afgevallen. Incubeer elke groep teken in de bevochtigingskamer tot de eiafzetting is voltooid. Evalueer de eiafzetting per groep door de eimassa te wegen die is geproduceerd door alle teken in een groep om het fenotype van de teken na het voeden te evalueren.

Bepaal het aantal teken dat is overleefd en bereken het gewicht van de tekenen, evenals de positie van de ova en de fertiliteit van de eieren. Afhankelijk van het doelewitgen en de doelstellingen van de studie kunnen andere analyses worden uitgevoerd om gene silencing via R-T-P-C-R te bevestigen. Dissekeer na het voeden de speekselklieren en darmen van individuele tekenen uit de controle-geïnjecteerde groep en de groep die is geïnjecteerd met dubbelstrengs RNA, en extraheer vervolgens het totale RNA uit de individuele weefselmonsters.

Analyseer de transcripten van het doelgen in individuele weefsels via real-time R-T-P-C-R en normaliseer de RNA-niveaus ten opzichte van teken 16 s ribosomaal RNA. Gebruik de gene norm-methode, voer aan het einde van de reactie dissociatiecurves uit om te bevestigen dat er slechts één amplicon wordt gevormd en dat de amplicons consistent denatureren in hetzelfde temperatuurbereik voor elk monster, en vergelijk de genormaliseerde CT-waarden voor mRNA-niveaus tussen tekenen die met een controle zijn geïnjecteerd en tekenen die met dubbelstrengs RNA zijn geïnjecteerd met behulp van de student t-toets.

Het hier beschreven protocol is in ons laboratorium gebruikt voor RNAi bij veel verschillende exotische teeksoorten. De hoeveelheid dubbelstrengs RNA die in de teken wordt geïnjecteerd, varieert afhankelijk van de grootte van de teek. Grotere teeksoorten kunnen een groter volume accommoderen.

De referenties kunnen worden gevonden in het bijbehorende geschreven gedeelte van het protocol. Als het protocol correct wordt uitgevoerd, zou de mortaliteit als gevolg van de injectieprocedure na 24 uur minder dan 5% moeten zijn. Een typisch fenotype na gene knockdown in teken wordt hier getoond, waarbij een groep teken werd geïnjecteerd met pools van dubbelstrengs RNA die werden gebruikt om te screenen op beschermende tekenantigenen.

Bij teken die met lichtmicroscopie worden onderzocht, kan cellulaire degeneratie in het tekenweefsel worden waargenomen. Fenotypische veranderingen kunnen gepaard gaan met functieverlies. Zo resulteert RNAI van SUBIN in steriele mannetjes die niet succesvol kunnen paren met de vrouwtjes na RNA-interferentie en teken.

Andere methoden kunnen worden gebruikt om de impact van gene silencing op gen- en eiwitexpressie en op de biologie van de teek te bepalen, waaronder real-time R-T-P-C-R, licht-, elektronen- of confocale microscopie, genomics of proteomics. RNA-interferentie kan ook worden uitgevoerd in teekcelculturen en biedt een in vitro methode voor het bestuderen van interacties tussen teekcellen en pathogenen.