Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in

Het doel van deze procedure is om de functionele relaties tussen bacteriële genen en pathways te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst arrays van Escherichia coli voor te bereiden, bestaande uit enkelvoudige mutantstammen die geconjugeerd of gepaard zullen worden. De tweede stap is het conjugeren van de enkelvoudige mutanten in een array-formaat op platen.

Vervolgens worden de dubbele mutanten geselecteerd. De laatste stap is het afbeelden van de platen met dubbele mutanten en het kwantificeren van de dubbele mutantkoloniën om de fitness van de stam te bepalen. Uiteindelijk worden de gegevens over de koloniegrootte geanalyseerd om genetische interactiescores te berekenen en functioneel interagerende genen, signaalpaden en processen te identificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals willekeurige mutagenese, is dat er veel individuele dubbele mutantstammen kunnen worden gecreëerd. Bovendien kunnen de interacties tussen veel genen gelijktijdig worden beoordeeld, ongeacht de gengrootte, essentialiteit of de fitness van de enkelvoudige genmutant. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de systeembiologie, zoals die betreffende genfuncties en functionele crosstalk tussen pathways en processen.

De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van bacteriële infecties, aangezien kennis over de meeste functioneel centrale genen en processen, evenals het begrip van welke combinaties van bacteriële genen, pathways en processen de bacteriële fitness verbeteren of verminderen wanneer ze worden verstoord, zal helpen bij het ontwikkelen van de meest effectieve interventiestrategieën. Om met dit protocol te beginnen, wordt een tweestaps geneste PCR-amplificatie gebruikt om het doel-open reading frame te vervangen door een chloramphenicol-resistentiemarker van het PKD-3-plasmid, zoals beschreven in de geschreven procedure.

Bevestig het verwachte product en zuiver het verkregen fragment via PCR-zuivering volgens het protocol van de fabrikant. Na het elueren van het PCR-product in 30 µL steriel gedestilleerd water wordt dit verdund tot een concentratie van ongeveer 50 mg/µL. Het gezuiverde product wordt bij -20 °C bewaard voorafgaand aan de transformatie.

Bereid vervolgens de high frequency of recombination (HFR) Cavalli-competente cellen voor voor de constructie van de donor. Inoculeer eerst één milliliter van een verzadigde overnight-cultuur van de HFR Cavalli-stam in 70 milliliter vers LB-medium met 35 µL van 50 mg/mL ampicilline in een kolf van 250 milliliter.

Incubeer de cultuur bij 32 °C onder zachte schudding bij 220 RPM totdat een optische densiteit van ongeveer 0,5 tot 0,6 is bereikt. Verplaats de cultuur vervolgens naar een waterbad voor hitte-inductie van het Lambda Red Recombinatiesysteem bij 42 °C gedurende 15 minuten, met schudden bij 160 RPM om de inductie te stoppen. Verplaats de cultuur naar een gekoeld waterbad met ijssleet gedurende 10 tot 20 minuten bij 160 RPM.

Zorg ervoor dat de cellen koud blijven tot na de transformatie. Na het wassen en oogsten van de cellen door centrifugatie, zoals beschreven in het geschreven protocol, schenk het supernatant af en resuspendeer het pellet in 500 µL ijskoud, 10% glycerol Eloqua. Verdeel de cellen in volumes van 50 µL over individuele, vooraf gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuizen en ga onmiddellijk over tot de transformatie.

Voeg 100 nanogram van de gezuiverde gen-deletiecassette toe aan de competente cellen. Tik tegen de buis en laat de suspensie vijf minuten op ijs rusten. Breng de suspensie vervolgens over naar een vooraf gekoelde electroporatiecuvet en electroporeer het celmengsel onmiddellijk.

Voeg één milliliter SOC-medium op kamertemperatuur toe en overbreng de geëlectroporeerde cellen in medium naar een cultuurbuis van 15 milliliter. Incubeer de cellen gedurende één uur bij 32 °C met orbitale schudding op 220 RPM. Centrifugeer de cellen na incubatie 5 minuten bij 4.400 ×g.

Verwijder bij kamertemperatuur ongeveer 850 µL van het supernatant en resuspendeer de celpellet in de resterende vloeistof. Verspreid de cellen op LB-platen die 17 µg/mL chloramphenicol bevatten en incubeer deze gedurende de nacht bij 32 °C. Strijk de volgende dag twee individuele transformanten uit op LB-chloramphenicolplaten voor bevestiging van de mutant; strijk dezelfde transformanten uit op LB-kanamycineplaten om te bevestigen dat de stammen niet kanamycine-resistent zijn.

Vervolgens wordt het DNA geamplificeerd met drie verschillende sets primers voor de bevestiging van de knockout, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. De eerste primer-set bestaat uit een flankerende forward primer van 20 nucleotiden, gelegen 200 basenparen stroomopwaarts van de doelregio, en een reverse primer die complementair is aan de chloramphenicol-resistentiecassette. Er wordt verwacht dat deze amplificatie een amplicon van 445 nucleotiden oplevert.

De tweede set bevat een forward primer, die annexeert aan de chloramphenicol-resistentiecassette-sequentie, en een reverse flankerende bevestigingsprimer, die is ontworpen om 200 baseparen stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van het verwijderde gen te annealen. Van deze amplificatiereactie wordt verwacht dat deze een amplicon van 309 nucleotiden produceert. De derde PCR bevat zowel upstream als downstream flankerende primers.

Deze reactie is vereist om te bevestigen dat de geselecteerde stam geen marrow-diploïde is waarbij één genlocus is vervangen door de cassette en een andere gedupliceerde, maar anders wild-type genkopie nog steeds aanwezig is. Van deze amplificatie wordt verwacht dat er een product van 1,4 KB wordt geproduceerd. De e coli ke io collectie van enkelvoudige niet-essentiële gen-deletiemutanten is robotisch gerepliceerd naar 24 384.

Vul een microplaat met 80 µL vloeibaar LB-medium per well. Vul dit aan met 50 µg/mL kanamycine. Maak ruimte voor de border control-stam, die dient als positieve controle en helpt bij de normalisatie van de platen en de geautomatiseerde koloniekwantificering. Verwijder het geinoculeerde medium uit de buitenste wells van elke plaat en breng dit over naar nieuwe platen, zodat de buitenste wells leeg blijven.

Creëer op dezelfde wijze negatieve controleplekken door twee willekeurige stammen van een andere locatie op elke plaat te verwijderen en deze stammen over te brengen naar een nieuwe plaat. Vul vervolgens de lege putjes, inclusief de controleputjes aan de rand en de negatieve controleputjes, met LV-medium dat 17 micrograms per milliliter chloramphenicol bevat. Van deze negatieve controleplekken wordt verwacht dat ze leeg blijven in de recipiënt- en dus in de dubbele mutantplaten.

Deze dienen om te waarborgen dat er geen fouten zijn gemaakt bij de verwerking of het hanteren van de plaatst bij het nummeren van de beelden of het pinnen van de platen. Na het voorbereiden van de positieve randstam zoals beschreven in de schriftelijke procedure, worden de array-stammen en de positieve randstam gedurende de nacht gekweekt bij 32 °C met een orbitale schudbeweging van 190 RPM. Vul de volgende dag de randputjes met ongeveer 80 µL van de overnight-cultuur. De geassembleerde platen kunnen worden gebruikt voor paring zoals beschreven in de volgende sectie.

Als alternatief wordt voor langetermijnopslag elke well in de ontvangstplaten aangevuld met 15% glycerol en worden het medium en glycerol gemengd. De platen worden vervolgens bewaard bij minus 80 °C. Begin de paringsprocedure door de HFR-donorstam, die de deletie van het query-gen draagt gemarkeerd met een chloramphenicol-resistentiecassette, overnacht te kweken bij 32 °C in rijk LB vloeibaar medium met 17 µg/mL chloramphenicol.

De bestelde collectie receptormutanten van TH werd in een 384-koloniedichtheid uitgeplaat op vaste LB-platen, aangevuld met 50 µg/mL kanamycine. Parallel hieraan werd de donor-querymutantstam in een 384-koloniedichtheid op hetzelfde aantal LB-platen uitgeplaatst.

Aangevuld met 17 µg/mL chloramphenicol. Incubeer de platen overnight bij 32 °C om de stammen te laten conjugeren. Pin de donor van de 3 84-kolonie overnight-donorplaten over naar vaste LB-platen.

Krijg vervolgens de stammen van een enkele 384-kolonie overnacht-recipientplaat over de vers gepinte donoren. Incubeer de gepinte conjugatieplaten bij 32 °C gedurende 16 tot 24 uur. Pin daarna elke 384-dichtheids conjugatieplaat op een enkele vaste LB-plaat die chloramphenicol bevat.

Herhaal dit proces totdat alle conjugatieplaten zijn gepind. Incubeer de vers gepinde eerste selectieplaten gedurende 16 tot 36 uur bij 32 °C. Pin na incubatie elke eerste selectieplaat opnieuw over naar een tweede dubbele drugselectieplaat in 1536 SPOT-formaat, zodat elke kolonie van de eerste selectie wordt vertegenwoordigd door vier kolonies.

Incubeer de platen op de tweede selectieplaat gedurende 16 tot 36 uur. Fotografeer bij 32 graden de uiteindelijke dubbele mutant-selectieplaten om de groeifitness van de mutanten kwantitatief te meten en de interacties tussen genparen te analyseren. Aangezien genen in dezelfde route nauw gecorreleerde GI-patronen vertonen, kunnen functioneel verwante genen worden gegroepeerd door ze te clusteren op basis van de algemene gelijkenis van hun S-scoreprofielen.

De gelijkenis van het GI-profiel vertegenwoordigt de congruentie van de fenotypes na mutatie van twee genen en zou indicatief moeten zijn voor het feit of de twee genen in hetzelfde of in overlappende routes werken. Hier wordt de verdeling van correlatiecoëfficiënten getoond tussen de GI-profielen van genparen die coderen voor fysiek interagerende eiwitten versus willekeurig getrokken genparen. Een voorbeeld van een scatterplot van gecorreleerde genetische profielen voor twee transporters die een heterotrimeer complex vormen dat vereist is voor sperma-excretie, wordt getoond met een gist ecoline gen.

Verlichtende interacties met sterk gecorreleerde GI-profielen hebben de neiging om paden te coderen die fysiek geassocieerd zijn of die coherent optreden in een gemeenschappelijke biochemische route. Hier wordt een representatief voorbeeld getoond waarin de componenten van de functioneel redundante ISC- en SUF-ijzer-zwavel-biosynthesepaden, die gezamenlijk deelnemen aan een essentieel proces, verschillende clusters vormen die door uitgebreide verergende interacties met elkaar zijn verbonden. Een statistische maatstaf kan worden gebruikt om elke significante verrijking van interacties tussen specifieke combinaties van paden te vinden, evenals voor de integratie van GI-netwerken met fysieke interacties en andere functionele associatiegegevens, zoals de genomische context.

Relaties kunnen de organisatie van functionele modules van hogere orde onthullen die kernbiologische systemen in bacteriën definiëren. Clusteranalyse kan ook worden toegepast op GI-netwerken om de functies van geannoteerde genen te voorspellen. Aangezien clusteringalgoritmen variëren.

Veronderstelde functionele toewijzingen die via clustering zijn bepaald, vereisen echter een onafhankelijke experimentele verificatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden alle noodzakelijke positieve en negatieve controles op te nemen. Andere methoden zoals proteomics, biochemische follow-upexperimenten en chemische genomics kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over specifieke genfuncties, alsook over de aard van functionele relaties tussen genen en signaalpaden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u dubbele mutantstammen construeert, recipiënt-arrays assembleert en ESGA-screenings uitvoert om de functionele relaties tussen genen en processen in e coli te onderzoeken.