Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Het algemene doel van deze procedure is om het virale tropisme bij een HIV-geïnfecteerde patiënt af te leiden door het sequencen van de V3-regio van het virale envelopgen. Begin met het extraheren van HIV-RNA uit het bloedplasma van de patiënt. Amplificeer vervolgens de V3-regio van HIV gp120 middels nested RT-PCR. Identificeer daarna de aanwezigheid van het product via gelelektroforese, gevolgd door populatiegebaseerde sequencing van de geamplificeerde V3-producten.

Analyseer tot slot de sequenties met base-callingsoftware en leid het gebruik van co-receptoren af met het genome-to-pheno-algoritme. Uiteindelijk kunnen deze resultaten aantonen of de virale tropisme van een patiënt R5 of non-R5 is via populatiegebaseerde sequencing van de HIV-1 V3-loop. Het primaire voordeel van deze tropisme-assay ten opzichte van bestaande methoden, zoals fenotypische celgebaseerde assays, is dat deze in elk laboratorium met sequencingapparatuur kan worden uitgevoerd, tegen lagere kosten, in minder tijd en met minder startmateriaal.

Deze techniek is relevant voor de behandeling met antiretrovirale therapie, omdat hiermee kan worden vastgesteld of de virale populatie van een patiënt waarschijnlijk zal reageren op een CCR5-antagonist op basis van 500 µL plasma. Gebruik een EasyMag geautomatiseerde extractor om HIV-RNA te extraheren. Ga nu naar een PCR-schone ruimte om de RT-PCR voor te bereiden, om zo een adequate bemonstering van de virale populatie te garanderen.

Plan om elke reverse transcriptiereactie in drievoud uit te voeren in deze één-stapsreactie. Gebruik viraal RNA om cDNA te synthetiseren, waarbij specifiek de HIVV three-regio wordt geamplificeerd met de SQV three F1 en CO 6 0 2 prime repair. Gebaseerd op de componenten per reactie.

Maak met een repeaterpipet een voorraadmixoplossing die voldoende is voor het aantal te amplificeren monsters. Voeg 36 µl van de monstermix toe aan elke put van de PCR-plaat. Schakel nu over op een multikanalpipet om microliters RNA-monsterextract over te brengen naar elke aangewezen put. Let erop dat de tips tussen elke toevoeging worden gewisseld.

Zodra de overdracht is voltooid, worden de wells afgesloten met PCR-stripdoppen. Plaats vervolgens de PCR-plaat in een thermocycler die is geprogrammeerd voor een one-step RT-PCR van de HIVV three regio. Gebruik voor de nested PCR de SQV three F two en CD four R primer pair.

Bereken de hoeveelheid reagens die nodig is voor het aantal monsters dat in een PCR-schone ruimte moet worden geamplificeerd. Maak de nested PCR-mix en gebruik vervolgens een repeaterpipet om 19 µL per well van een schone PCR-plaat te aliquoteren. Na voltooiing van de R-T-P-C-R dient men naar een ruimte voor na-amplificatie te gaan.

Gebruik een achtkanals multichannelpipet om één µL van het RT-PCR-sjabloon over te brengen naar het nested PCR-mengsel. Verschoon de tips tussen elke toevoeging. Sluit de wells af met PCR-stripdoppen en plaats de plaat in een thermocycler voor amplificatie.

Verwijder de plaat uit de thermocycler nadat de temperatuur is teruggekeerd naar 25 °C. Om te bevestigen dat de V3-regio succesvol is geamplificeerd, worden de producten eerst geanalyseerd middels gelelektroforese. Bereid een 1,6% agarosegel voor met cyber safe gelkleuring.

Gebruik een multichannelpipet van 10 µL. Breng 8 µL PCR-monsters over naar de betreffende putjes. Laad daarnaast een DNA-ladder in ten minste één putje per rij.

Laat de gel ongeveer 10 minuten lopen bij circa 100 volt. Visualiseer de banden via ultraviolette fluorescentie en leg het beeld vast met een foto. Noteer de monsters waarbij alle triplicaat amplificaties succesvol waren.

Indien nodig wordt de R-T-P-C-R herhaald voor die monsters met minder dan drie productamplificaties. De geamplificeerde virale cDNA-monsters worden verder geverifieerd door DNA-sequencingreacties uit te voeren met de V 3 0 2 F en S QV three R one primers. Haal het big di-reagens uit de vriezer en laat het ontdooien bij kamertemperatuur.

Bereken en bereid de reagentia voor die nodig zijn voor het aantal te analyseren monsters. Pipetteer vijf microliters van het sequeneringsreactiemengsel in de juiste putjes van de plaat met behulp van een multichannelpipet. Bedek de plaat met een Kim wipe en zet deze opzij.

Bereid ondertussen een verdunning van 1:15 van het geamplificeerde PCR-product voor door 180 µL steriel water toe te voegen aan het resterende PCR-product. Pipetteer 1 µL van het verdunde monster naar de bodem van de betreffende plaatputjes. Vers Jikaal altijd de tips tussen de monsters wanneer de monsteroverdracht is voltooid.

Sluit de plaat af met stripdoppen en vortex deze gedurende één seconde. Om de plaat te centrifugeren, stelt u de snelheid in op 140 5G. Stop het centrifugeren zodra de spinsnelheid 140 5G bereikt.

Plaats de plaat in een thermocycler om de reactie te laten verlopen. Precipiteer in elke well het DNA met 4 µL 3 M natriumacetaat en 40 µL gekoelde 95% Ethanol, en sluit de doppen opnieuw. Vortex de plaat 10 seconden en tik tegen de plaat om eventuele luchtbellen te verwijderen.

Plaats de platen bij -20 °C gedurende 30 minuten tot twee uur. Win het DNA terug door centrifugatie bij 2000 G gedurende 20 minuten. Verwijder de stripdoppen en gooi deze weg.

Keer de plaat boven de afvalbak om en schenk het supernatant af. Verwijder het resterende supernatant door de omgekeerde platen op een papieren handdoek te deppen.

Vouw twee vellen keukenpapier om de plaat in te pakken. Plaats de plaat met de voorkant naar beneden in de centrifuge en centrifugeer bij 140 5G. Stop het centrifugeren zodra 140 5G is bereikt.

Was daarna met 155 µL 95% ethanol en schenk dit af. Herhaal vervolgens de centrifugatie. Laat de plaat twee tot vijf minuten staan zodat de laatste resten ethanol kunnen verdampen.

Om de DNA-monsters te denatureren, gebruikt u een meerkanaals pipet om 10 µL high dye for maide te verdelen over alle wells op de plaat, inclusief de lege wells. Sluit de plaat af met een septumafoer en plaats deze in een thermocycler bij 90 °C gedurende twee minuten. Plaats tot slot de monsterplaat in een sequencingplaat en vervolgens in de sequencer.

Een aanvaardbare methode voor data-analyse is het gebruik van de software Recall om automatische base calling uit te voeren zonder menselijke tussenkomst. Recall is een gratis, op maat gemaakte software voor base calling; log in en selecteer met de optie 'browse' de monsterbestanden die moeten worden geüpload. Zoek het bestand met de ruwe sequencing-data en upload tot 20 megabytes.

Stel vervolgens de referentiesequentie in op V drie. Klik op 'process data'. Selecteer de resulterende map aan de rechterkant van de pagina om de lijst met monsters weer te geven.

De rode monsters zijn afgekeurd. De groene monsters zijn goedgekeurd. Door op een specifiek monster en vervolgens op de knop 'view' te klikken, kunt u de sequentie bekijken, de instructies aan de rechterzijde van de pagina volgen om door de sequentie te navigeren en bestanden downloaden in een zip-map.

Viraal tropisme kan worden afgeleid uit sequenties die zijn gegenereerd via populatiegebaseerde sequencing met behulp van het geno-to-pheno co-receptoralgoritme. Selecteer in het vervolgkeuzemenu van de significante instelling de optie geoptimaliseerd op basis van analyse van klinische gegevens van motivate 2% en 5.75% FPR. Kies nu om een sequentie te uploaden of te plakken voor analyse.

FASTA-bestanden zijn acceptabel. Voeg geen andere bestanden toe om over te gaan naar het verkrijgen van een geno Tono FPRA-voorspeller van de respons op CCR five-antagonisten. Het gegenereerde G two P-rapport geeft de V three-loopsequentie in aminozuren weer en geeft relevante posities aan van mutaties die geassocieerd zijn met non R five-gebruikend virus.

Onderaan het rapport wordt de fout-positieve ratio gegeven en geïnterpreteerd in termen van de respons op een CCR5-antagonist. Dit rapport kan worden gedownload als PDF-bestand. Als uit één van de drie sequenties van een monster wordt afgeleid dat het geen R5 is, is de kans klein dat de patiënt reageert op een CCR5-antagonist zoals verwacht; gelelektroforese van RTP-CR-amplificaties van de HIV-1 V3-loop geeft aan dat niet alle klinische monsters een product produceren.

De gegenereerde sequenties van de geamplificeerde monsters kunnen worden gevisualiseerd in een chromatogram dat via recall wordt uitgelezen. Er wordt een schone sequentie met weinig mengsels verwacht. Af en toe kunnen sequenties onduidelijk zijn en zich niet lenen voor een nauwkeurige basistoewijzing.

Sommige patiënten kunnen worden geïdentificeerd als dragers van een virus dat geen gebruikmaakt van CCR five, zoals hier wordt getoond. Deze patiënten zullen waarschijnlijk niet reageren op een behandeling met een CCR five-antagonist. De meerderheid van de patiënten blijkt echter een virale populatie te hebben die bestaat uit een virus dat gebruikmaakt van CCR five, wat wordt aangegeven door een groen kader onderaan het G two P-analyserapport.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze van begin tot eind in ongeveer vier dagen worden uitgevoerd. Dat omvat de periode van extractie tot analyse. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe viraal tropisme kan worden voorspeld met behulp van populatiegebaseerde sequencingsmethoden in combinatie met het genome pheno bioinformatica-algoritme.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.