Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen

Het algemene doel van deze procedure is om gag-genen afkomstig van personen geïnfecteerd met subtype-C HIV1 in een replicatiecompetent HIV1-plasmid te incorporeren, om zo het effect van gag-sequentiepolymorfismen op de HIV1-replicatiecapaciteit in vitro te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst het gag-gen uit het plasma van de patiënt te amplificeren. De tweede stap is het klonen van de gag-sequentie van de patiënt in de replicatiecompetente infectieuze moleculaire kloon MJ-four. Vervolgens wordt het gag-MJ-four chimeer-plasmid getransfecteerd om infectieuze virale stocks te genereren, waarna de titer wordt bepaald om de infectiviteit op een indicator-cellijn te beoordelen. De laatste stap is het meten van de in vitro replicatiecapaciteit in de GXR-25 T-cellijn. Uiteindelijk wordt een radiogemarkeerde reverse transcriptase-assay gebruikt om de virionproductie in de tijd te kwantificeren om zo de virale replicatiekinetiek te visualiseren.

De methode die we vandaag gaan beschrijven, kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het HIV-onderzoeksveld. Hiertoe behoort het definiëren van de determinanten van de replicatieve fitness van HIV en het begrijpen van hoe de fitness van HIV de langetermijnpathogenese beïnvloedt. De methoden zullen vandaag worden beschreven door Jessica Prince en Dan Claiborne, twee van mijn promovendi.

Om deze procedure te starten, wordt cDNA vanuit RNA reverse getranscribeerd en worden de DNA-producten van de eerste ronde geamplificeerd met behulp van een reverse transcriptase en een thermostabiele DNA-polymerase in een one-step RT-PCR. Voer vervolgens een nested PCR-amplificatie van een tweede ronde uit, waarbij één µL van de PCR-amplificatie uit de eerste ronde als DNA-template wordt gebruikt. Voeg daarna drie µL 5X laadkleurstof toe aan vijf µL van het reactievolume van de tweede ronde.

Voer de elektroporese uit bij 120 volt op een 1% agarose TAE-gel die een UV-fluorescerende DNA-kleurstof bevat, totdat de banden gescheiden zijn. Visualiseer vervolgens de 1,6 KB-banden op een blauwe lichtilluminator. Voer daarna het resterende reactievolume van 45 microliter uit op een 1% agarose TAE-gel die de DNA-kleurstof bevat. Snijd de juiste banden uit met een schoon scheermesje en combineer drie positieve reacties per individu. Extraheer vervolgens DNA uit het gelstuk met behulp van een gelzuiveringskit en elueer dit in nucleasevrij water. Vries het product in bij minus 20 graden Celsius voor later gebruik. 0:15:56 In deze procedure worden, na amplificatie van de long terminal repeat five prime UTR-regio van het MJ-vier-plasmide, de 1,3 KB PCR-producten op de illuminator gevisualiseerd. Snijd de positieve ampliconen uit, zuiver ze vervolgens en vries ze in zoals eerder beschreven. Creëer daarna de gefuseerde MJ-vier LTR gag-ampliconen via splice overlap extension PCR. Visualiseer, snijd uit, zuiver en vries het 3,2 kb lange amplicon in. Digesteer nu 1,5 microgram MJ-vier-plasmide en 1,5 microgram gezuiverd LTR-gag PCR-product met BCL-one restrictie-endonucleasedurende 1,5 uur bij 50 graden Celsius. Voeg vervolgens één microliter NGOM-vier toe aan de digestiereactie en incubeer deze één uur bij 37 graden Celsius. Voeg daarna 5x loading dye toe aan de restrictiedigestiereacties. Voer langzaam elektroporese uit van het totale volume op een 1% agarose TAE-gel die een DNA-kleurstof bevat gedurende één tot twee uur bij 100 volt. Visualiseer, snijd uit en zuiver de aangegeven banden voor klonering zoals eerder beschreven.

Bereid vervolgens de ligatiereacties voor met gezuiverd LTR-gag insert en MJ-four vector DNA in een insert-vectorverhouding van drie op één. Incubeer de ligatiereacties gedurende de nacht bij 4 °C.

Transformeer vervolgens chemisch competente JM-109 bacteriën met ligatieproducten, uitgestreken op LB-agarplaten met 100 micrograms per milliliter ampicilline. Kweek de getransformeerde bacteriën gedurende ten minste 22 uur bij 30 degrees Celsius. Om de kloningsgetrouwheid te bevestigen, wordt het miniprep-DNA onderworpen aan een dubbele digestie met de restrictie-enzymen NGOM-four en HPA-one bij 37 degrees Celsius gedurende twee uur.

Analyseer dit vervolgens op een 1% agarose TAE-gel. Bereken het benodigde volume virus vanuit elke voorraad op basis van de IU per microliter titer uit een TZM-BL-celassay, om vijf keer 10⁵ GXR-25-cellen te infecteren bij een multiplicity of infection van 0,05. Zorg ervoor dat u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt voor het werken met replicatiecompetent HIV, waaronder een volledige laboratoriumjas, mondmasker en dubbele handschoenen. Haal op de dag van infectie de virusvoorraden uit de vriezer van -80 °C en ontdooi deze. Verdun vervolgens het virus in C-R-P-M-I-medium tot een volume van 100 µL om een MOI van 0,05 te bereiken. Voeg dit toe aan de v-bodem weefselkweekbehandelde 96-wellplaat, inclusief zowel een positieve als een negatieve controle in elke set replicatie-experimenten, en richt de plaat zo in dat elke tweede kolom leeg blijft om kruiscontaminatie tussen de wells te beperken. Tel vervolgens de GXR-25-cellen met een automatische celsteller en bereken het totale aantal cellen dat nodig is voor alle infecties. Aliquoteer het vereiste volume in een conische buis van 50 mL en centrifugeer om de cellen te pelletteren. Aspireer vervolgens voorzichtig het medium en resuspendeer in C-R-P-M-I bij een concentratie van vijf keer 10⁵ cellen per 100 µL. Pipetteer de cellen in een steriel reservoir en meng grondig. Voeg vervolgens met een multichannel-pipet 100 µL cellen toe aan elke well van de 96-wellplaat die het verdunde virus bevat en meng grondig. Voeg daarna twee µL van een 5 mg/mL polybrene-oplossing toe aan elke well en meng de cellen grondig. Incubeer vervolgens gedurende drie uur bij 37 °C in een weefselkweekincubator met 5% CO2.

Om de geïnfecteerde cellen te wassen, wordt de 96-wells V-bodemplaat gecentrifugeerd om de cellen te pelletteren. Verwijder vervolgens voorzichtig 150 µL van het medium en vervang dit door 150 µL vers C-R-P-M-I zonder het celpellet te verstoren. Herhaal deze procedure nog twee keer om de cellen voldoende te wassen. Na de laatste centrifugatie en de toevoeging van 150 µL C-R-P-M-I wordt het celpellet geresuspendeerd met een multikanalenpipet. Voeg het mengsel uit elke well toe aan 800 µL C-R-P-M-I in een well van een 24-wells weefselkweekplaat. Plaats de plaat vervolgens in een 5% CO2 weefselkweekincubator bij 37 °C. Overdraag elke twee dagen 100 µL supernatant van het oppervlak van de kweekwell naar een well van een 96-wells U-bodemplaat en vries dit in voor latere analyse met de RT-assay. Resuspendeer vervolgens de cellen grondig en verwijder de helft van het resterende volume om overgroei van de cellen te voorkomen. Herstel daarna het oorspronkelijke volume door 550 µL vers C-R-P-M-I aan elke well toe te voegen.

Voeg bij deze procedure één tot twee microliter van 10 millicurie per milliliter DTTP en vier microliter van één molar DTT toe aan elke aliquot van één milliliter RT-mastermix. Meng elke 1,5 milliliter microcentrifugebuis met RT-mastermix, DTT en DTTP zorgvuldig met een 1000 microliter pipette en breng dit over naar een steriel trogje.

Dispenseer vervolgens 25 µL van de gelabelde RT-mix in elke put van een 96-put PCR-plaat met dunne wanden. Voeg vijf µL van elk supernatant toe aan de PCR-plaat die de RT-mastermix bevat. Seal de PCR-plaat vervolgens met een adhesieve foliecover en incubeer deze twee uur lang bij 37 °C in een thermocycler. Maak na incubatie kleine gaatjes in de foliecover met een 200 µL multichannelpipet. Meng de monsters vijf keer. Breng vijf µL van elk monster over op DE-81 papier en laat alle monsters 10 minuten aan de lucht drogen. Plaats de blots in afzonderlijke wasbakken. Was de blots vervolgens vijf keer met 1X SSC. Was ze daarna twee keer met 90% ethanol gedurende vijf minuten per wasbeurt voordat ze aan de lucht worden gedroogd. Wikkel de blot na het drogen voorzichtig in Saranwrap en stel deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur bloot aan het phosphoscreen in een luchtdicht gesloten cassette.

Zodra ze klaar zijn, analyseert u de fosforbeeldschermen met een phosphor-imager en kwantificeert u de radioactieve transcripten.

Getoond. Hier zijn de representatieve gelbeelden die de elektroforetische scheiding laten zien van de verschillende PCR-amplicons die nodig zijn om een patiëntafgeleid gag-amplicon te genereren dat in de MJ-four plasmid-backbone kan worden gekloond. Dit representatieve gelbeeld toont de elektroforetische scheiding van restrictiedigesten voor het klonen van patiënt-gag-genen in MJ four.

En deze representatieve gelafbeelding toont de elektroforetische scheiding van restrictiedigesten van een gezuiverd gag MJ-four chimera plasmide-DNA. Deze grafiek toont de reproduceerbaarheid van de replicatie-assay over tijd in de GXR-25 cellijn. Dezelfde gag MJ four chimere virussen werden gebruikt om GXR-25 cellen te infecteren in twee onafhankelijke experimenten die ongeveer een jaar na elkaar werden uitgevoerd.

Replicatiescores werden gegenereerd door de helling van log-getransformeerde DLU-waarden te berekenen en deze helling te normaliseren ten opzichte van wildtype MJ-four. De twee onafhankelijke metingen zijn sterk gecorreleerd en benadrukken de reproduceerbaarheid van assays die op verschillende tijdstippen en met cellen met verschillende passagen zijn uitgevoerd. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in het veld van HIV/AIDS om de virale determinanten van pathogenese te verkennen bij acute subtype C-infecties, het meest voorkomende subtype wereldwijd. Werken met replicatie-competent HIV kan extreem gevaarlijk zijn. Alle stappen waarbij levend virus betrokken is, moeten worden uitgevoerd in een BSL 2+ faciliteit. Alle oppervlakken moeten regelmatig worden gedecontamineerd en er moeten te allen tijde dubbele handschoenen worden gedragen.