Murine eilandjes van Langerhans Isolatie

Hoi, ik ben Greg Zott. Ik ben verbonden aan het UCSF Diabetes Center in het Bluestone Laboratory, en vandaag ga ik u het proces laten zien voor het isoleren van muis-eilandjes van Langerhans. De procedure omvat de injectie van een collagenase-oplossing in de pancreas van een C3 H donor-muis, waarna we die pancreas verwijderen, deze laten verteren, de eilandjes zuiveren met behulp van een Fial-gradiënt en ze vervolgens handmatig selecteren voor transplantatie in het nierscapsel van een diabetische NOD-muis, die als ontvanger zal dienen.

Voordat we met deze procedure beginnen, hebben we onze ATE-oplossing verdund in een gemodificeerde Hanks-buffer en hebben we de concentratie aangepast specifiek voor de muizenstam die we gebruiken, de C3 H. We stelden vast dat digesties beter verlopen bij een collagenase-oplossing van 0,8 mg/mL, en we zullen dit gebruiken voor injectie in de ductus choledochus om de pancreas te distenderen. De procedure wordt vandaag uitgevoerd door Pavo Codre van het diabetescentrum. Hij zal de muis openmaken, de darmen blootleggen en vervolgens injecteren in de ductus choledochus.

We besproeien de muis met ethanol om de haren plat te houden en controleren vervolgens met een knijpprik in de teen of de muis correct is geofferd. Pavo opent nu de muis en legt de darm en de pancreas bloot met een midline incisie. Het diafragma wordt eveneens doorgesneden om te verifiëren dat de muis is geofferd.

Voordat we beginnen, wil ik enkele belangrijke structuren aanwijzen. De maag ligt hier, met de pancreas die eronder aan het duodenum en daarboven is vastgehecht. Dit is de lever, waar we de galblaas en de ductus choledochus vinden, die u hier kunt zien.

Wat Pavo vervolgens zal doen, is de dunne darm isoleren en bepalen waar de gemeenschappelijke galgang de dunne darm binnenkomt. Zodra de darm is blootgelegd, plaatsen we aan weerszijden van de gemeenschappelijke galgang mosquito-klemmen. We stellen vast dat dit meer collagenates toelaat om de pancreas binnen te dringen, terwijl andere groepen proberen de klem direct bovenop de gemeenschappelijke galgang te plaatsen.

We stellen vast dat dit een betere techniek is om het enzym de pancreas in te laten gaan. Dit is een voorzichtige procedure. Het is belangrijk om scheuren in de darm te voorkomen.

Zorg dat de klemmen rusten aan weerszijden van de ductus choledochus. Nu zoeken we de galblaas op; zodra deze is blootgelegd, gebruiken we deze als richtlijn om de collagenase in de ductus choledochus te injecteren. Powell gebruikt een naald van 30 gauge met een spuit van 5 cc die 3 mL collagenase-oplossing bevat.

Terwijl hij de gemeenschappelijke galgang binnengaat, zet hij deze gang uit met een collagenase-oplossing en gaat hij vervolgens door de gemeenschappelijke galgang naar beneden tot hij vlakbij de darm komt. Terwijl hij naar beneden gaat, wordt de enzymoplossing in de pancreas gepompt. Nu de pancreas is opgezwollen met de collagenase-oplossing, zal Powell de hemostaten verwijderen en vervolgens de pancreas zorgvuldig losscheuren van de darm om deze uit de muis te verwijderen.

Hij verwijdert het uit de maag. Oké, en vervolgens gebruikt hij de milt als houvast om de pancreas op te tillen, waarna hij deze langzaam doorsnijdt bij de gemeenschappelijke galgang, en dat is alles. De pancreas is vrijgelegd en vervolgens wordt de milt verwijderd, waarna hij het mesenteriale weefsel verwijdert. Daarna wordt de pancreas in een collagenase-oplossing van 2 mg geplaatst in een gesteriliseerd glazen vial en opnieuw op ijs gezet.

De geïsoleerde pancreas die we in de glazen vials hebben geplaatst, wordt nu gedurende ongeveer 17 minuten in een waterbad van 37 °C gezet. We hebben ze in een conisch rek van 50 ml geplaatst om te voorkomen dat ze gaan drijven. Zodra ze in het bad zijn, start de timer en begint de digestie.

Zodra de digestietijd is verstreken, worden de vials verwijderd, waarna ze voorzichtig worden geschud en gedestructureerd. Zodra het weefsel begint uiteen te vallen, wordt het vial op ijs geplaatst. Een steriel zeefje wordt geplaatst over een bekerglas van 400 ml dat wasbuffer bevat.

Het pancreassuspensaat wordt vervolgens voorzichtig door het zeefje in de wasbuffer gegoten. Ten behoeve van de demonstratie is de afzuigkap uitgeschakeld en is het glas van de kap omhooggeschoven, zodat we kunnen zien wat we doen. Zodra het pancreassuspensaat in het bekerglas is gegoten, worden de vials gespoeld met dezelfde wasbuffer en wordt de wasbuffer door het zeefje gegoten.

We hebben een spuit gevuld met wasbuffer. Deze gebruiken we om het weefsel krachtig door het zeefje te wassen. Het doel is om alle losse oogjes die niet aan de matrix vastzitten te verwijderen, terwijl de membranen en het onverteerde weefsel op het zeefje achterblijven.

En wanneer u klaar bent met het wassen van een weefsel, is dit wat u gewoonlijk aan het einde van de procedure ziet. Het pancreasweefsel onderin de buis wordt nu overgebracht naar twee conische buizen van 50 ml; het weefsel wordt gewassen, gelijkmatig gemengd en vervolgens gelijkmatig verdeeld, zodat er in elke buis een gelijk pelletvolume is. Het bekerglas wordt nu gespoeld met meer wasbuffer.

De wanden worden gespoeld zodat al het weefsel dat in de beker is terechtgekomen, opnieuw wordt opgenomen. Vervolgens wordt dit gelijkmatig verdeeld over beide buizen, telkens 50 ml. De conische buizen worden daarna aangevuld met wasbuffer.

Het weefsel wordt meerdere keren omgewend en vervolgens in een centrifuge geplaatst. Dit is een korte centrifugatiestap. De centrifuge wordt op 1000 RPM gebracht en daarna uitgeschakeld.

Het weefsel is op dit moment zeer gevoelig en u wilt voorkomen dat het te veel wordt samengedrukt. De buisjes worden verwijderd en we zullen deze wasstap nog drie keer herhalen. Dit is het einde van de derde wasbeurt.

De componenten van de 50 ml conische buis worden overgebracht naar de 15 ml conische buis en gecentrifugeerd op 1000 rpm en vervolgens gestopt. Het supernatant wordt verwijderd en het eerste deel van de FI Call wordt gestart. We zijn nu bij de stap waarin we ons gepellette pancreasdigest hebben.

We resuspenderen dat weefsel zodat het mooi loskomt van de pellets. We voegen de eerste dichtheidsgradiënt toe, namelijk 1 1 0 8. We voegen vijf ml toe aan elke buis.

Het pellet wordt vervolgens grondig gemengd in elk van de gradiënten. Het is belangrijk dat er een goede weefselverdeling in de zwaarste gradiënt wordt bereikt. Nu voegen we twee ml van een dichtheid van 1,096 toe in een laag.

Vervolgens voegen we daarop een laag van twee mil met een dichtheid van 1 0 6 9 toe, en daarop vervolgens een laag met een dichtheid van 1 0 3 7. Het is belangrijk dat u de dichtheden niet mengt tijdens het aanbrengen van de lagen. Alle lagen zijn nu aan de buis toegevoegd.

En u kunt zien dat dit de bovenkant is van 1 1 0 8, de bovenkant van 9 1 0 9 6, de bovenkant van 1 0 6 9 en de bovenkant van 1 0 3 7. En u kunt zien dat het weefsel al begint te bewegen naar de juiste dichtheid, zelfs zonder centrifugatie. De fiale gradiënten worden op snelheid gebracht op 1800 RPM gedurende 15 minuten, en vergeet niet de rem uitgeschakeld te laten nadat de buizen uit de centrifuge zijn gehaald.

Tussen de laag 0 0 9 6 en 0 0 7 is een mooie band eilandjesweefsel zichtbaar. Nu wordt de laag 0 3 7 verwijderd om eventuele weefselresten en DNA te elimineren die tijdens de verwerking zijn vrijgekomen. Met behulp van een steriele plastic Pasteurpipet verwijdert hij nu de eilandjeslaag en brengt deze over naar een conische buis van 50 ml die 25 ml wasbuffer bevat.

Voer deze stap snel uit omdat fol toxisch is voor de oogjes. We hebben daadwerkelijk de gehele 0 6 9 en 0 9 6 laag verwijderd. Pavo knipt de bovenkant van de plastic Pasteur-pipet af en spoelt deze met washbuffer.

De oogbollen worden vervolgens gecentrifugeerd op dezelfde wijze als voorheen. De centrifuge wordt tot 1000 RPM gebracht, waarna we deze stoppen en het supernatant aspirationseren. De oogbollen worden drie keer gewassen met wasmedium.

We hebben zojuist het proces voor de isolatie van eilandjes voltooid, waarbij we zijn gegaan van de digestie naar de fol-gradiënt en vervolgens naar de gezuiverde eilandjes. Na onze derde wasbeurt met wasbuffer hebben we de eilandjes opnieuw gesuspendeerd in ons RPMI-medium en in een weefelkweekplaat geplaatst. Deze eilandjes zijn nu klaar voor in vitro assays of in vivo preparaties, zoals een eilandjes transplantatie.