Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

Het algemene doel van deze procedure is om succesvol eilandjes van Langerhans te isoleren uit een muizenpancreas. Dit wordt bereikt door eerst de pancreas te isoleren van het omliggende weefsel. Vervolgens wordt de galgang gecannuleerd, zodat de pancreas kan worden opgeblazen met het collagenase-proteasemengsel.

Zodra de pancreas is opgeblazen, wordt deze verwijderd en worden de eilandjes zorgvuldig gedissocieerd. Ten slotte worden de geïsoleerde eilandjes gefilterd en uitgeplaat voor toekomstig gebruik. Uiteindelijk wordt deze methode van eilandjesisolatie met gezuiverde collagenase en neutraal protease gebruikt om een maximale opbrengst aan eilandjes en een optimale morfologie van de eilandjes te verkrijgen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor de isolatie van eilandjes van Langerhans is dat we de variabiliteit tussen verschillende batches hebben geëlimineerd door gebruik te maken van gezuiverde enzymen. Daarnaast hebben we enkele protocollen gewijzigd of verbeterd om de morfologie van de eilandjes te optimaliseren. Bedek na euthanasie de romp met 70% ethanol voordat de buikholte volledig wordt geopend, van de anus tot het diafragma.

Plaats de muis vervolgens op het platform van een dissectiemicroscoop. Trek het caecum en het colon ascendens naar buiten en leg deze buiten de lichaamsholte aan de linkerzijde; verschuif de leverloben tegen het diafragma aan. Als deze daar niet uit zichzelf blijven liggen, vergroot dan de opening van de lichaamsholte.

Pak het duodenum vast met een gebogen pincet en lokaliseer het bundel van de arteria hepatica, de vena portae en de galgang die naar de lever leidt. Gebruik een ander paar gebogen pincetten om een hechtdraad onder de bundel van slagader, ader en gang aan te brengen en trek deze zo dicht mogelijk bij de lever aan.

Pak met twee paren gebogen pincetten voorzichtig het duodenum vast en zoek de galgang op ter hoogte van de papil. Gebruik één poot van het pincet om door de pancreas en het bindweefsel direct onder de galgang en nabij de papil te prikken. Plaats het pincet snel door het gat en breng een hechtdraad in. Knoop de hechtdraad losjes rond de galgang om met behulp van een 90-graden pincet een kleine cirkel te vormen.

Trek de dunne darm strak tot de galgang gespannen is. Maak met superscherpe scharen één horizontale snede door de papil, terwijl u de darm vasthoudt en ervoor zorgt dat de galgang niet losraakt van de papil. Voer een canule in de galgang in en trek vervolgens voorzichtig de hechtdraad rond de canule aan.

Vul vervolgens een spuit van drie milliliter met 2,0 milliliters van het collagenase-protease-mengsel. Injecteer dit mengsel met een langzaam, constant tempo in de canule. Nadat de pancreas volledig is opgeblazen, wordt de canule uit de galgang verwijderd.

Begin bij de neergaande dikke darm en knip het bindweefsel door terwijl de darmen worden opgetild totdat de galgang is bereikt. Scheid vervolgens de pancreas van de milt en het omringende weefsel. Knip tot slot de hechtingen door en verwijder de pancreas.

Plaats de pancreas na verwijdering in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter HBSS op ijs. Wanneer alle monsters zijn verzameld, worden alle buizen van 50 milliliter met pancreasweefsel in een waterbad van 37 graden Celsius geplaatst. Schud de buis gedurende 15 minuten voorzichtig en controleer of het weefsel is gedissocieerd.

Zorg ervoor dat het weefsel gemakkelijk uiteenvalt door de buis bij het dopje vast te houden. Draai de buis 12 keer rond om het weefsel verder te dissociëren. Voeg maximaal 30 milliliters HBSS toe en centrifugeer.

Aspirer het supernatant voorzichtig en laat een kleine hoeveelheid supernatant op de bodem achter om het celpellet niet te verstoren. Voeg met een spuit van 30 milliliter voorzien van een naald van 14 gauge niet meer dan 10 milliliter HBSS toe en aspireer de suspensie twee keer op en neer. Filtreer het celmengsel door een plastic T-zeef in een buis van 50 milliliter.

Spoel met nog eens 10 milliliters HBSS en centrifugeer. Giet het supernatant af en keer de buisjes om zodat ze gedurende één minuut kunnen uitlekken op een absorberend papieren handdoekje. Resuspendeer elk buisje in 10 milliliters.

Koud 1100. Zijn ondoorzichtige overlay, de zijn ondoorzichtige Met 10 milliliter HBSS en centrifugeer. Verwijder de volledige 20 milliliter supernatant met een 25 milliliter pipette met grote boring en leid de supernatant door een omgekeerd filter van 70 micron.

Filter de eyelets direct in een Petrischaal en spoel door 10 milliliters eyelet-medium via pipetteren door de filtercultuur te leiden. Bewaar de eyelets in een weefselkweekincubator tot ze klaar zijn voor experimentatie. De opbrengst, morfologie en kwaliteit van de eyelets zijn de algemene parameters die worden gebruikt om het succes van de eyelet-isolatie te beoordelen.

De typische morfologie van de eilandjes wordt hier getoond. De eilandjes hebben een ronde tot langwerpige vorm met een relatief uniforme grootte. Geïsoleerde eilandjes werden geanalyseerd op glucose-gestimuleerde insulinesecretie.

De insulinestimulatie was vergelijkbaar tussen de eilandjes die waren geprepareerd met Sigma Type 11 in vergelijking met ci zyme TM, MABP, wat duidt op een hoge kwaliteit van de eilandjespreparatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een galgang van een muis canneleert. Werk met zyme collagenase en neutroproteasen om uw eilandjes te isoleren voor elke assay.