High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Het algemene doel van deze procedure is om micro-RNA-expressie efficiënt, goedkoop en met een minimale hoeveelheid startmateriaal te profileren door multiplex kwantitatieve R-T-P-C-R te combineren met een microfluïdisch platform. Dit begint met het concentreren van geëxtraheerd RNA, gevolgd door multiplex reverse transcriptie en multiplex pre-amplificatie. De volgende stap is het zuiveren om overtollige primers te verwijderen.

Ten slotte wordt de singleplex micro RNA-expressie geprofileerd met behulp van een microfluidisch platform. Het resultaat is nauwkeurige en zeer reproduceerbare micro RNA-expressieniveaus over de monsters van belang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de extra zuiveringsstap na pre-EMP amplificatie de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de multiplex Q-R-T-P-C-R methode verbetert.

Begin met RNA dat uit serum is geëxtraheerd. Bij het gebruik van een RNA-zuiveringskit of een op fenol-chloroform gebaseerde RNA-methode vanuit gehomogeniseerd weefsel zoals triol, moeten alle extracties worden gevolgd door een wasstap en dient alle opslag plaats te vinden bij -80 °C. Concentreer de RNA-oplossing.

Als u begint met een beperkte hoeveelheid monster, zoals eerst uit serum, plaatst u dan een MicroCon-monsterreservoir in een vial en pipetteert u de RNA-oplossing in het reservoir, waarbij u er zeer goed op moet letten dat u met de pipetpunt het membraan niet aanraakt. Plaats vervolgens de vial en het filter in de centrifuge met de markering richting de rotor en laat de centrifugatie ongeveer drie uur lopen. Na drie uur is het RNA volledig op het membraan geconcentreerd om het RNA te elueren.

Voeg de gewenste hoeveelheid RNAse-vrij water toe aan het membraan, keer het reservoir om en plaats het in een nieuw vial. Centrifugeer vervolgens gedurende drie minuten bij 4 °C met maximaal 3000 ×g. Bewaar het geconcentreerde RNA bij -80 °C tot gebruik. Na het uitvoeren van een RT-reactie op het RNA met xpl reverse stem-loop primers, gevolgd door 12 tot 18 PCR-cycli, worden de microRNA's vertegenwoordigd door cDNA-strengen.

Dit wordt het pre-PCR-product genoemd, met betrekking tot de komende qPCR. Het pre-PCR-product moet worden gezuiverd op een 10% polyacrylamidegel, samen met een DNA-ladder van 10 basenparen; vul elke baan met 5,5 µL van zes x oranje G gecombineerd met 27,5 µL van het pre-PCR-product.

Laat de gel lopen bij 150 volt gedurende 55 tot 60 minuten. Romo fenolblauw loopt op deze gel in het gebied van 20 basenparen. Nadat de gel is gelopen, wordt deze 25 minuten gekleurd met CyberGOLD, beschermd tegen licht en op een schudplaat vanaf de gekleurde gel.

Snijd de pre-PCR-productband van 60 tot 80 basenparen uit en breng het gelblok over naar gelabelde buisjes. Als de productconcentratie laag is, is deze mogelijk niet zichtbaar, maar bevindt deze zich nog steeds in de gel. Verbrijzel de gelband vervolgens middels tube-in-tube centrifugatie en voeg 300 µL TEN-buffer toe.

Incubeer het buffer-gelmengsel gedurende vier uur bij 37 °C onder agitatie. Breng het vloeistof na vier uur over naar een nieuwe buis en voeg nog 300 µL TEN-buffer toe. Incubeer dit mengsel overnacht bij 4 °C onder agitatie.

Overdraag de volgende dag de inhoud van de buis opnieuw en voer een ethanolprecipitatie van het pre-PCR-product uit. Wanneer een chip uit de verpakking wordt gehaald, moet deze binnen 24 uur worden geprimed en vervolgens binnen 60 minuten na het primen worden geladen. Begin met het primen van de array door 150 microliters control-lijn-vloeistof in elk van de accumulatoren op de chip te injecteren.

Zorg ervoor dat er geen vloeistof op de chip of de inlaatpunten morst, anders wordt de chip onbruikbaar. Plaats de chip vervolgens in de geïntegreerde fluïdische schakeling of IFC-controller en voer het priming-script van de controller uit. Begin met het voorbereiden van de monsters zodra het programma start.

Begin met het bereiden van de pres-samplemix. Meng een combinatie van tack man, universal master mix en ladingsreagentia. Combineer vervolgens, gebruikmakend van het 96-well laadformaat, 2,25 µL van elk monster met 2,75 µL pres-samplemix om de geladen vloeistof te verzamelen. Vortex kortstondig en centrifugeer de plaat snel bij 4 °C.

De monsterplaat is nu gereed. Gebruik nu een nieuwe 96-wells plaat om 13 x concentraties van het assay-mengsel voor te bereiden. Dit gebeurt door per well één universele primer, een forward primer en een genspecifieke TaqMan-probe te mengen.

De 1X concentraties zijn 1 µM voor de universele en forward primer en 0,2 µM voor de TaqMan-probe. Voeg vervolgens voldoende Tween toe voor een eindconcentratie van 0,25% Tween in een eindvolume per well van 5 µL. Meng goed terwijl luchtbellen worden vermeden en centrifugeer de plaat kort om de vloeistof te verzamelen.

Dit is de assayplaat. Begin de 96.96 Q-R-T-P-C-R door de chip te laden. Laad eerst de monsters en vervolgens de assays met een eindvolume van 5 µL per inlaat in de IFC.

Voer vervolgens het load mix-script uit om de monsters en assays in de chip te laden. Wanneer het script is voltooid, pelt u de beschermfolie van de geladen chip en verwijdert u eventuele stofdeeltjes of vuil van het chipoppervlak met behulp van plakband. Stel nu het amplificatieprogramma van het biosysteem in.

Plaats de chip in het systeem en start het programma. De resultaten kunnen worden geanalyseerd met fluid dime-software om amplificatiecurven, heatmaps van de gehele chip en CT-waarden voor elke put te verkrijgen, gebruikmakend van pre-PCR-producten van wild-type DG CR eight en de ER-null-mutant, gezuiverd door groottescheiding op native polyacrylamidegels.

RNA werd klaargemaakt in vergelijking met eerdere protocollen. Meer microRNA's en een afname van fout-positieve signalen treden op in zowel DGCR eight null als ER null achtergronden dankzij de zuiveringsstap. Daarnaast maakt de aangepaste QR TPCR R benadering een juiste categorisering mogelijk van zeldzame D gcr eight onafhankelijke dicer afhankelijke kleine RNA's.

Hier werden 48 cera van patiënten en controles gescreend op expressieveranderingen van 384 verschillende microRNA's. De gegevens werden voor elk monster genormaliseerd door de overeenkomstige mediaan af te trekken en zonder gebruik van een spike in de controles. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe multiplex Q-R-T-P-C-R op een flu line-platform kan worden gebruikt om gelijktijdig honderden micronasen in veel monsters te profileren, zelfs wanneer er wordt gestart met zeer beperkte input-RNA.