Profilering van de Pre-micro-RNA's en microRNA's met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Het algemene doel van deze procedure is om een snelle en betrouwbare geautomatiseerde opzet van qPCR-gebaseerde arrays mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de primer-sets voor de array voor te bereiden en de sample mastermixen op te stellen die gescreend moeten worden. Vervolgens wordt er ofwel een geautomatiseerde robotische PCR-opstelling of een matrix elektronisch pipetsysteem gebruikt om de sample mastermix en primer-sets nauwkeurig in elke put van een 384-well plaat over te brengen.

Zodra deze zijn voorbereid, worden de PCR-reacties in de 384-wells uitgevoerd met het PCR-programma van de LightCycler 480. De laatste stap van de procedure is het analyseren van de qPCR-gegevens en het bepalen van de relatieve expressieniveaus voor elk getest primerpaar, waarbij elk paar gericht is op een specifiek mRNA. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in de expressie van grote sets mRNA's laten zien.

Speciaal ontwikkelde arrays kunnen daarom via qPCR-gebaseerde profilering gericht zijn op volledige pre-microRNA-profielen, specifieke pathways of moleculen die essentieel zijn voor virale infecties. Hallo, ik ben Dirk DMA van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of North Carolina at Chapel Hill. Vandaag laten we u zien hoe u real-time qPCR opzet en we zullen u twee methoden tonen.

Eén met een handmatige pipette en één met een robot. We gebruiken deze technologie om pre-microRNA's en mature microRNA's in menselijke tumoren te meten. De demonstratie vandaag zal worden verzorgd door Pauline Chu en Kristen bu.

Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, haal je de primerplaten op die 186 primerparen bevatten in een 96-well formaat bij 0,5 picaMoles, bewaard bij -20 °C.

Nadat de platen op kamertemperatuur zijn ontdooid, worden ze kort gevortext en gecentrifugeerd. Ontdooi daarnaast de Cyber Green Two Times PCR-mix op kamertemperatuur; voor de opstelling van elke 96-wells primerplaat zijn vier mastermix-buisjes nodig. Bereid de mastermix voor door per reactie 4 µL Cyber Green-mix, 3 µL PCR-water en 10 tot 20 ng monster-DNA of cDNA te combineren in elk van de vier 2 mL Eppendorf-buisjes.

Elke buis moet voldoende mastermix bevatten voor ongeveer 100 reacties, waarbij rekening is gehouden met een overschot voor pipetteerverlies. Vortex de buizen om te mengen. Begin met de opstelling van de precursor micro RNA-assay met behulp van de freedom Tecan EVO-robot, inclusief de initialisatie van de robot en het laden van het EVO-wearprogramma.

Spoel de robot vervolgens drie keer met 30 milliliters systeemvloeistof om het systeem te ontdoen van luchtbellen die de nauwkeurigheid van het pipetteren kunnen beïnvloeden. Stel daarna het robotplatform zo in dat er een 384-wells plaat en een 96-wells primerplaat aanwezig zijn. De mastermixen, een trog met 2%bleach, een gevulde systeemvloeistofcontainer en een lege afvalcontainer.

Start de geautomatiseerde robotrun door aan het einde van het programma tweemaal op run te klikken. Verwijder de 384-well plaat en verzegel deze met LightCycler 480 sealing foil. Centrifugeer vervolgens de plaat.

Plaats de verzegelde 384-wellplaat kortweg in positie één van het hotel. Herhaal dit proces vervolgens voor primerplaat twee met nieuwe mastermixen en een nieuwe 384-wellplaat. Plaats de resulterende verzegelde 384-wellplaat in positie twee van het hotel.

Open een nieuw EVO wear-programma om de light cycler vanuit het hotel te laden en stel de cyclusparameters in. Selecteer vervolgens twee keer 'run'. Freedom Evo zal automatisch elke plaat in de light cycler laden en het cyber green one HRM-cyclusprogramma uitvoeren.

Zodra dit voltooid is, dienen de resultaten te worden beoordeeld en geanalyseerd zoals beschreven in het schriftelijke protocol, als alternatief voor het gebruik van de robot. Een elektronische multichannel pipet voor platen kan worden gebruikt om de inhoud van de buis met de mastermix in een reservoir te plaatsen.

Stel de elektronische pipet zo in dat er 16 µL mastermix wordt opgezogen, gevolgd door twee afgiftestappen van eight µL en een spoelstap. Nadat de pipet is ingesteld, worden 16 µL mastermix opgezogen en wordt gestart met het dispenseren in een 384-wheelplaat. Doseer de eerste 8 µL in om en om rijen in kolom één, gebruikend rijen A tot O, waarbij de volgende kolom leeg blijft.

Dispenseer de tweede acht µL in dezelfde rijen van kolom drie. Spoel vervolgens boven een afvalbak door en verwijder de tips volgens dit patroon waarbij om en om rijen en kolommen worden overgeslagen. Herhaal dit proces over de plaat voor vijf verdere cycli om master mix twee te pipetteren.

Gebruik dezelfde rijen als voor mastermix één, maar begin bij kolom twee. Herhaal deze procedure voor mastermix drie en vier, beginnend bij respectievelijk kolom één en twee, maar gebruik ditmaal rij B tot P van de primerplaat. Stel een elektronische pipette in om 2 µL op te zuigen en 2 µL te dispenseren, gevolgd door een spoelstap.

Breng twee µL primers over van kolom één, rij A tot H van een 96-well primerplaat naar om en om een rij in kolom één van de 384-well plaat; spoel boven een afvalbak door en gooi de tips weg. Herhaal dit patroon voor de quatt primer voor de drie resterende mastermixen in kolom één en twee. Zet dit proces vervolgens voort voor kolom twee tot 12 van de 96-well primerplaat, waarbij u voor elke primerkolom telkens twee kolommen overslaat in de 384-well plaat.

Verzegel vervolgens de platen met een plafond voor de light cycler, folie en centrifugeer ze. Plaats de platen na het centrifugeren kort in een light cycler 480 en voer de cycli uit met behulp van het Cyber Green I HRM-detectieformaat.

Herhaal deze procedure met dezelfde cycluseringsvoorwaarden als voorheen, gebruikmakend van primerplaat twee Eloqua in een nieuwe 384-wellplaat met vers bereide mastermixen. Precursor micro-RNA-signaturen komen naar voren door profilering met gebruik van een nieuwe QPCR-gebaseerde array. De gemiddelde delta CT, genormaliseerd ten opzichte van U zes, werd berekend en de gestandaardiseerde waarden werden in de array geladen.

Software-analyse resulterend in drie verschillende clusters, weergegeven als heatmaps. De relatieve expressie van elk precursor micro RNA wordt getoond, waarbij rood en blauw respectievelijk een toename en afname in relatieve expressie vertegenwoordigen. De kleurintensiteit geeft de mate van expressieverandering aan.

De meerderheid van de precursor microRNA's onderging kleine, onbetekenende veranderingen, zoals verwacht. Een klein deel van de precursor microRNA's vertoonde echter een significante toename gedurende het experimentele tijdverloop. Daarnaast nam het relatieve niveau van enkele precursor microRNA's drastisch af.

In sommige gevallen clusteren ze ook samen in de heatmap-analyse. Afhankelijk van het experiment kunnen er clusters ontstaan die afhankelijk zijn van virale infectie, celtype-specifieke expressie van precursor microRNA's of precursor microRNA's die worden gereguleerd door een gemeenschappelijk molecuul of signaleringspad.

De gemiddelde drempelcycli of ct-waarden van een negatief monster voor het Kaposi-sarcoma-geassocieerde herpesvirus, uitgevoerd in viervoud, worden getoond. Belangrijk is dat het Kaposi-sarcoma-geassocieerde herpesvirus latentie-geassocieerde nucleaire antigeen of KSHV Lana niet in dit monster werd gedetecteerd door de hooggevoelige QPCR-array. Beide interne controles, U6 en let-7a (een sterk tot expressie gebracht micro-RNA-precursor van de mens), werden echter tot detecteerbare niveaus tot expressie gebracht.

Ten slotte, zoals verwacht, leverde de negatieve controle van PCR-water geen A-Q-P-C-R-product op. Een smeltcurve-analyse voor twee verschillende primers, waarbij hetzelfde monster-duplicaat is gebruikt, wordt getoond.

Het is duidelijk dat de smelttemperatuur verschilt voor de twee primerparen, maar de sample smelt bij exact dezelfde temperatuur voor elk replicaat. Tekenen van een slechte of potentieel gecontamineerde sample kunnen meerdere smeltpieken zijn, wat kan wijzen op de aanwezigheid van twee verschillende inputbronnen. We hebben zojuist aangetoond hoe u real-time QPCR-experimenten opzet met behulp van een robot.

Het is belangrijk dat u alle controles en zoveel mogelijk housekeeping-genen opneemt. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.