Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Het algemene doel van deze procedure is het monitoren van veranderingen in de mitochondriale calciumconcentratie in levende cellen. Dit wordt bereikt door cellen eerst te transfecteren met het ratiometrische calciumindicatoreiwit peram, dat gericht is op de mitochondriale matrix, één of twee dagen vóór de transfectie. De fluorescentiemicroscoop en de bijbehorende software worden ingesteld voor live-cell imaging.

Na toevoeging van een calciummobiliserende agonist worden vervolgens beelden van cellen die ratiometrische Peram tot expressie brengen, vastgelegd. De laatste stap van de procedure is de kwantitatieve analyse van de verkregen beelden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die dynamische veranderingen in de mitochondriale calciumconcentratie laten zien via fluorescentiemicroscopie van levende cellen die een ratiometrisch calciumindicator-eiwit tot expressie brengen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het meten van calciumgehaltes met behulp van synthetische calciumindicatoren, is dat ratio metric peram genetisch gecodeerd is en daardoor gericht kan worden op mitochondria of elk ander orgaan van belang. Hallo, ik ben Dr. Ascar, postdoc in het laboratorium van Dr. Benning, en ik zal vandaag de procedure demonstreren. Om te beginnen met het protocol: plaat de HeLa-cellen de avond voorafgaand aan de transfectie op steriele glazen dekglasjes in een standaard zes-wells kweekplaat, met een dichtheid die op de dag van transfectie ongeveer 70% confluent zal zijn. Bereid de volgende dag DNA-Lipofectamine 2000-complexen voor volgens de instructies van de fabrikant, met 4 µg van de metric peram mitochondriaal expressievector en 10 µL Lipofectamine 2000 verdund in 0,5 mL Opti-MEM voor elke te transfecteren well.

Vervang vervolgens het D-M-E-M-F-B-S HELOC-kweekmedium in elke put door 1,5 milliliters van hetzelfde medium zonder antibiotica. Voeg de LIPECTOMY-oplossing toe aan de DNA-oplossing en meng voorzichtig nadat de complexen zijn gevormd. Voeg de DNA-Lipectomy-oplossing druppelsgewijs toe aan elke te transfecteren put, meng door de plaat voorzichtig te schudden en incubeer gedurende vier uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide na de incubatie.

Vervang het medium door D-M-E-M-F-B-S met antibiotica. Laat de cellen één tot twee dagen metric peram tot expressie brengen voordat u met een pincet overgaat tot beeldvorming. Plaats met zorg een dekglas met HELOC-cellen in een geschikte beeldvormingskamer met beeldvormingsoplossing.

Plaats de beeldkamer op de tafel van een omgekeerde microscoop. Gebruik vervolgens een olie-immersieobjectief van 40x of hoger en een golflengte van 380 nanometer. Om een interessegebied te vinden met één of meer cellen die ratio metric peram tot expressie brengen, wordt hier 380 nanometer gebruikt om de cellen als ratio metric te identificeren.

Peram is minder resistent tegen fotobleken bij deze golflengte. Zodra een gebied van belang is geïdentificeerd, stelt u de software in voor dubbele excitatie bij 495 en 380 nanometers. Neem vervolgens sequentieel beelden op door afwisselend te exciteren bij 495 en 380 nanometers.

Leg beelden vast van de calciumspiegels bij de baseline gedurende ten minste 30 seconden vóór de toediening van de agonist. Dien vervolgens de calciummobiliserende agonist toe via een perfusieapparaat, waarbij de toevoegingstijd voor elke agonist wordt genoteerd; de blootstellingstijden aan de agonist en de acquisitie-intervallen moeten worden geoptimaliseerd om fotobleking te voorkomen, terwijl een voldoende temporele resolutie behouden blijft. Zodra het experiment is voltooid, kunnen de beelden offline worden geanalyseerd.

Om de analyse te starten, selecteert u een interessegebied binnen een leeg gebied van het gezichtsveld om indien nodig de achtergrondfluorescentie af te trekken. Exporteer vervolgens de 4 95 3 80 ratio-metingen van het interessegebied naar Excel of vergelijkbare grafische software. Dit paneel van afbeeldingen toont de subcellulaire lokalisatie van ratio metric peram en mitochondria.

Links is een live-cell image van HeLa-cellen die ratio-metrisch Pericam tot expressie brengen. In het midden is de fluorescente kleuring van de mitochondriën met de selectieve kleurstof MitoTracker Red CMXRos te zien. En tenslotte, aan de rechterkant, is het samengevoegde beeld een serie pseudokleur-ratio-beelden van 495 en 580 nanometer van vier HeLa-cellen die ratio-metrisch Pericam in de mitochondriën tot expressie brengen en behandeld zijn met 10 µM ATP; de kwantificering van de veranderingen in de mitochondriale calciumspiegels van deze vier cellen wordt hier getoond in dit beeld van een HeLa-cel die ratio-metrisch Pericam in de mitochondriën tot expressie brengt.

Heterogeniteit van de calciumrespons in individuele mitochondriën, evenals significante fragmentatie van mitochondriën, is duidelijk zichtbaar na 60 minuten behandeling met 0,5 µM storsporine. Sommige mitochondriën vertonen oscillerende calciumtoenames, aangegeven met de witte pijl, terwijl andere geen significante veranderingen in het calciumgehalte vertonen, aangegeven met een gele pijl. Deze grafiek toont de verandering in de globale mitochondriale calciumgehaltes in een enkele HeLa-cel na inductie van apoptose gedurende 120 minuten met 0,5 µM storsporine.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe dynamische veranderingen in mitochondriale calciumspiegels als reactie op verschillende stimuli kunnen worden gemeten met behulp van het calcium-gemedieerde eiwit R geometric peram, dat selectief gericht is op de mitochondriale matrix.