Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae

Het algemene doel van deze procedure is om studenten in de bachelorwetenschappen kennis te laten maken met microarray-technologie door de expressieverschillen te bestuderen in gist die wordt blootgesteld aan oxidatieve stress. Dit wordt bereikt door eerst totaal RNA te isoleren uit gistculturen die zijn behandeld met waterstofperoxide en uit de onbehandelde controles. De tweede stap van de procedure is het genereren en zuiveren van cDNA uit deze RNA-monsters.

Het cDNA wordt vervolgens gebruikt om biotinyl-gelabeld cRNA te bereiden via in vitro transcriptie. De laatste stap van de procedure is de fragmentatie van de biotinyl-gelabelde cRNA's voor hybridisatie op de AFI metrics gist-genechips. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de expressieverschillen in de twee gistmonsters tonen en via bio-informatica aan undergraduate studenten de kracht van microarray-analyse demonstreren.

Het outreach-team van het Vermont Genetics Network bedacht deze methode toen zij de opdracht kregen om microarray-technologie aan wetenschapsstudenten in de hele staat Vermont aan te bieden om hun wetenschappelijke onderwijs te verbeteren. Tot nu toe is deze methode op meerdere locaties aan acht bachelorcolleges in de hele staat geïmplementeerd. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van microarray-onderwijsmodules is dat het ons in staat stelt om een groep individuen algemene moleculaire biologische technieken bij te brengen die dagelijks in het laboratorium worden gebruikt.

Daarnaast kunnen we dit gebruiken om zowel studenten als docenten en onze onderzoeksgroepen te onderwijzen. In de praktijk werken studenten en professoren samen aan hetzelfde project. Ze leren bepaalde technieken die veel finesse vereisen, zoals het omgaan met RNA, wat geen eenvoudige taak is.

Ze leren hoe ze DNA kunnen neerslaan met behulp van visualiseringsreagentia. Ze krijgen daadwerkelijk de kans om technieken toe te passen die ze zullen tegenkomen in hun master- of promotieonderzoek of in alledaagse moleculaire biologielaboratoria. Hoewel deze methode geschikt is voor het verkrijgen van inzicht in oxidatieve stress bij gist, is deze zeker toepasbaar op andere modelorganismen en andere biologische systemen die u wilt onderzoeken.

Genexpressie verandert door ontwikkelingsprocessen, omgevingstoxines, specifieke ziektebeelden en vele andere factoren. Om de expressieverschillen te onderzoeken in gist die aan oxidatieve stress wordt blootgesteld, wordt eerst totaal RNA uit twee gistculturen geëxtraheerd via enzymatische lyse. Eén cultuur werd blootgesteld aan oxidatieve stress door een behandeling van één uur met 0,5 millimol waterstofperoxide in Hank's gebufferde zoutoplossing, terwijl de andere cultuur alleen met HBSS werd behandeld als controle.

Begin met het labelen van twee microcentrifugebuisjes van 1,7 milliliter met de juiste identificatiegegevens. Breng 1,5 milliliter van de betreffende gistcultuur over in elk buisje. Centrifugeer de buisjes 2 minuten lang bij 5.000 Gs op kamertemperatuur.

Verwijder na centrifugatie voorzichtig de supernatant met een micropipet en gooi deze weg zonder het pellet te verstoren. Controleer of het pellet groot genoeg is voordat u verdergaat met de procedure. Als het pellet te klein is, voeg dan 1,5 milliliters kweek toe aan dezelfde buis waarin het pellet zich bevindt en centrifugeer vervolgens om een groter pellet te verkrijgen.

Verwijder het supernatant met een micropipet en verwijder zoveel mogelijk vloeistof van de gistpellet. Voeg vervolgens 100 µL SG-buffer en 30 µL liase-oplossing toe aan de gistpellet en meng dit door te vortexen. Incubeer beide buisjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Wervel elke buis voorzichtig elke 10 minuten om sferoplasten te genereren. Een van de meest kritische stappen bij het uitvoeren van sferoplast-plating van gist is om er zeker van te zijn dat er na de behandeling daadwerkelijk honderd procent sferoplasten zijn gevormd. Dit betekent dat niet alle lytische enzymen gelijkwaardig zijn.

U moet controleren of een goed lytisch enzym een goede sfero-plating oplevert, wat betekent dat u deze monsters op een microscoopglas moet aanbrengen en onder de microscoop moet controleren door 0,1% SDS toe te voegen om er zeker van te zijn dat er protoplasten zijn gevormd. Om een volledige sfero-plating waar te nemen, pipetteert u 10 µL van het gistmonster op een microscoopglas en onderzoekt u het monster onder de microscoop met 1 µL 0,1% SDS om de gistcellen te laten zwellen en perfecte sferen of sferoïden te vormen. Het is belangrijk om waar te nemen dat ook deделende cellen sferoïden vormen.

Als er gedeeltelijke sfero-plaatvorming wordt waargenomen, wordt een verlengde behandeling met liase aanbevolen. Zodra volledige sfero-plaatvorming is bevestigd bij 350 microliters BRLT-buffer per buis, worden er 250 microliters 100%ethanol toegevoegd. Zorg dat de buis stevig is afgesloten door het deksel dicht te houden en vortex krachtig gedurende één minuut.

Deze procedure wordt gebruikt om de Sphero-platen te lyseren. Gebruik daarna R en easy Z spin-kolommen om het RNA uit de twee culturen te verzamelen en te zuiveren. Evalueer tot slot de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA met behulp van een 1,2% precast agarosegel voor elektroforese om biotinyl-gelabeld cRNA voor te bereiden.

Het totale RNA dat uit de gistcellen is geëxtraheerd, wordt eerst gebruikt voor de synthese van cDNA via reverse transcriptie. Bereid na de generatie van cDNA de phase lock gel-buisjes voor gebruik bij de cDNA-precipitatie; centrifugeer de phase lock gel-buisjes op maximale snelheid gedurende één minuut om er zeker van te zijn dat de gel zich onderaan de buis bevindt. Vortex de phase lock-buisjes niet. Pipetteer voor de precipitatie van cDNA 162 µL van de onderste laag van een PCI-mengsel (pH 8,0 tris-gebufferde fenol-chloroform-isoamylalcohol) en voeg dit toe aan de 162 µL inhoud van de reactiebuis voor de synthese van de tweede cDNA-streng; voor deze stap zijn gelijke volumes van de waterige en organische mengsels vereist.

Vortex vijf seconden om de inhoud te mengen. Gebruik vervolgens een micropipet om het gehele CD N-A-P-C-I mengsel over te brengen naar de phase lock gel buis. Vortex de phase lock gel buis niet; centrifugeer op maximale snelheid gedurende twee minuten.

Gebruik vervolgens een micropipet om de bovenste laag van de phase lock gel-buis over te brengen naar een nieuw gelabelde buis van 1,7 milliliter. Probeer zoveel mogelijk van deze laag te verzamelen. Voeg het volgende toe aan de microcentrifugebuis van 1,7 milliliter: 405 microliters 100% ethanol, 80 microliters ammoniumacetaat en één microliter pellet paint, en vortex.

Plaats de buis kort in de centrifuge met het scharnier van de buis naar buiten gericht en centrifugeer 20 minuten op maximale snelheid. Neem de buis bij kamertemperatuur, zodra het centrifugeren is voltooid, voorzichtig uit de centrifuge, waarbij u erop let dat het CD NA-pellet niet wordt verstoord. Het pellet moet roze zijn vanwege de pelletverf en ongeveer de grootte van een zoutkorrel hebben.

Plaats de CD NA pellet op ijs aan de zijkant van de buis onder het scharnier en ga onmiddellijk over tot het reinigen van de pellet. Om de procedure voor het reinigen van de CD NA pellet te starten, gebruikt u een P 1000 micropipet om voorzichtig al het supernatant uit de buis te verwijderen. Let erop dat u de pellet niet verstoort.

Voeg 500 µL koude, 80% ethanol toe aan de buis met uw monster. Sluit de buis voorzichtig af en keer deze langzaam enkele keren om. Houd het pellet nauwlettend in de gaten om er zeker van te zijn dat het niet loslaat van de wand van de buis.

Als het pellet loslaat, kunt u het terug naar de bodem van de buis brengen door de buis terug in het rek te plaatsen en het pellet naar de bodem te laten zakken, of door de buis 15 seconden op maximale snelheid te centrifugeren. Gebruik vervolgens een P 1000 micropipet om voorzichtig de ethanol te verwijderen zonder het pellet te verstoren. Kantel de buis om zoveel mogelijk vloeistof te kunnen verwijderen.

Voeg een nieuw aliquot van koude, 80% ethanol toe, sluit de buis af en keer deze enkele keren langzaam om. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk ethanol met een P 1000 micropipet. Centrifugeer de buis vijf seconden op maximale snelheid.

Gebruik vervolgens een P 10 micropipet om de laatste microliters ethanol te verwijderen zonder het pellet te verstoren. Plaats de open buis gedurende 10 tot 20 minuten in een droogkast om de resterende ethanol te laten verdampen. Zodra het pellet droog is, kan het gemakkelijk verloren gaan; hanteer de buis daarom voorzichtig en sluit de dop.

Wanneer het drogen is voltooid, visualiseer dan het gedroogde pellet om te bevestigen dat dit in de buis aanwezig is. Resuspendeer het gedroogde pellet tot slot in 22 µL RNA-vrij water en plaats de buis op ijs. Dit cDNA wordt vervolgens gebruikt om biotine-gelabeld cRNA te prepareren via in vitro transcriptie met gebruik van de Enzo BioArray-kit.

Nadat het biotine-gelabelde cRNA is gereinigd en gekwantificeerd, wordt het gefragmenteerd voor de targetpreparatie. Zodra het cDNA is gegenereerd, gebruiken we standaard in vitro transcriptiemethodologie om gebiotinyleerd cRNA te produceren. Het cRNA moet worden gefragmenteerd voordat het op de microarraychip kan worden aangebracht.

Om deze procedure te starten, brengt u een hoeveelheid CRNA gelijk aan 5 µg over naar een gelabelde PCR-buis van 0,5 ml. Voeg voldoende RNase-vrij water toe om het totale volume op 16 µL te brengen, en voeg vervolgens 4 µL van een 5x fragmentatiebuffer toe aan de buis. Het totale volume in de buis moet 20 µL zijn.

Vortex de buis en centrifugeer gedurende 10 seconden. Incubeer de buis vervolgens 30 minuten bij 94 °C. Plaats de buis na de incubatie in een thermocycler op ijs.

Het gefragmenteerde en ongefragmenteerde CRNA van elk monster wordt vervolgens geanalyseerd via elektroforese met behulp van een 1,2% precast AROS-gel. Wanneer de run is voltooid, wordt de gel gevisualiseerd op een transilluminator en wordt er een afbeelding gemaakt. Het uiteindelijke syntheseproduct wordt gehybridiseerd met de atric gistgen-chips en representatieve resultaten van de microarray-analyse worden hier getoond.

Deze eerste figuur is een voorbeeld van een gescande afbeelding van een atrics gist-genechip, gegenereerd door de bedieningssoftware van de atrics-genechip. Dit is een 2D-spreidingsdiagram van alle genetische transcripten, ongeveer 6.700 genen, waarbij controlegegevens en behandelde gistgegevens worden vergeleken. Elk punt vertegenwoordigt één enkel gen.

Genen die paars gekleurd zijn, geven aan welke genen differentieel tot expressie komen, terwijl rood gekleurde genen dat niet doen. In dit voorbeeld zijn de meeste differentieel tot expressie gebrachte genen betrokken bij de controle van de celcyclus, zoals blijkt uit hun beschrijvingen. Dit stroomschema uit de database voor annotatievisualisatie en geïntegreerde ontdekking illustreert differentieel tot expressie gebrachte genen in een aangetast biologisch pad.

De genen die zijn aangegeven met een rode ster zijn de downregulated genen in het mitotische pad. Tot slot worden hier representatieve resultaten van een volcano plot getoond die is gegenereerd met de geo species gene sifter-software. Controle- en behandelde monsters werden vergeleken met een P-waarde drempelwaarde van 0,05 en een drempelwaarde voor expressieverandering van 1,5 fold.

We hebben gekozen voor het gebruik van gist omdat gist snel en eenvoudig te kweken is, maar we realiseerden ons ook dat het meest kritieke onderdeel van het werken met gist eigenlijk het creëren van een goede spheroplastenplating is. Een van de dingen die we bij microarray willen vermijden, is een onvolledige digestie, waardoor alleen spheroplastencellen worden geplate die zich in een G1- of een G2M-fase bevinden. Je zou dan een microarray-experiment uitvoeren op gistcellen die zich in een specifieke replicatiefase bevinden.

Een ander complex punt dat we in deze oefening willen duidelijk maken, is dat het pelleten van CD NA iets is waar mensen dagelijks over praten, maar dat het niet noodzakelijkerwijs eenvoudig is. In onze module hebben we daarom gespecialiseerde buisjes en visualiseringsreagentia gebruikt. Hierdoor kunnen we DNA daadwerkelijk centrifugeren en kun je de pellet visualiseren, wat het zowel voor studenten als docenten eenvoudiger maakt.

Zodat dit na de ontwikkeling in alle fasen van DNA- en RNA-werk kan worden gebruikt. Deze module heeft echt de weg vrijgemaakt voor docenten aan de Baccalaureate-instituten om verder te onderzoeken, mogelijk door te kijken naar andere modelorganismen of andere behandelingsregimes die compatibel zijn met bestaande curricula of mogelijk hun eigen onderzoeksinteresses. Om u een voorbeeld te geven van enkele van de wijzigingen die zijn aangebracht: er was één locatie die keek naar de effecten van herbicidenbehandeling op gist, een andere die keek naar LAMP IDE-behandeling in gist, terwijl een andere locatie keek naar de ontwikkelingsveranderingen in een mammale cellijn waarin zij specifiek geïnteresseerd waren.

En tot slot heeft een andere locatie gekeken naar de impact van differentiële lichtbronnen op arabidopsis of planten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het opzetten van een microray-experiment met bachelorstudenten in de wetenschap, inclusief de isolatie van totaal RNA uit gist, de generatie van cDNA en de fragmentatie van biotine-gelabeld cRNA. Praktijkervaring met dergelijke hoogwaardige technologieën helpt om het wetenschappelijk onderwijs op bachelorniveau te versterken en te consolideren.