Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van genexpressieprofielen die ten grond liggen aan talrijke fenotypes of metabole routes. Dit wordt bereikt door eerst mRNA te isoleren uit twee contrasterende nematode-stammen. De tweede stap van de procedure is het synthetiseren van cDNA dat ofwel S SI drie- of SFI-captursequenties bevat, en deze te hybridiseren met een microarray.

De derde stap van de procedure is het hybridiseren van de microarray met anti-capturesequenties die S SI drie en SCIFI fluoro fours bevatten. De laatste stap van de procedure is het scannen van de microarray en het analyseren van de gegevens met bio-informatische tools, zoals de magic tool software. Uiteindelijk worden kandidaatgenen geïdentificeerd die het onderzochte biologische fenomeen bemiddelen, welke gevalideerd en gekwantificeerd kunnen worden met alternatieve technieken zoals real-time PCR.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat de gespotte nucleotiden niet zichtbaar zijn voor de gebruiker, waardoor het moeilijk is om een homogeen hybridisatiemengsel over de ruim 23.000 uniek geprinte nucleotiden te plaatsen. Begin met het verzamelen van RNA uit gezonde gesynchroniseerde nematoden. Eerst worden ze gewassen, resuspendeerd in buisjes van 15 milliliter en gecentrifugeerd; de wormpellets worden vervolgens geresuspendeerd in 7 ml 0,1 M NaCl en 7 ml ijskoude, 60% w/v sucrose.

Na een incubatie van 15 minuten op ijs worden de wormen opnieuw gecentrifugeerd tot een pellet. De nu bacterievrije wormen zullen naar boven zwemmen, worden verzameld, gewassen in RNAse-vrij water en opnieuw gecentrifugeerd. Vervolgens wordt de schone, los samengedrukte pellet overgebracht naar een microcentrifugebuisje en 30 seconden op maximale snelheid gecentrifugeerd.

Gespireerd en bewaard in 10 volumes RNA later bij vier graden Celsius tot het moment van verwerking. Om totale RNA-monsters voor te bereiden, worden de bereide pellets op maximale snelheid gecentrifugeerd, waarna het supernatant wordt weggegooid en een snufje moleculaire maalgel op de pellet wordt gevoegd. Vries vervolgens het mengsel in met vloeibare stikstof met behulp van een stamper.

Maal de bevroren wormsuspensie tot een fijn poeder; voeg indien nodig vloeibare stikstof toe om het poeder na het malen koud te houden. Plaats het extract vijf minuten op ijs. Meng na vijf minuten het extract met in totaal 700 µL R-L-T-B-M-E en 472 µL 100% ethanol.

RNA kan nu worden geïsoleerd met behulp van een commercieel verkrijgbare kit tot een eindvolume van 60 µL geïsoleerd RNA per biologisch monster. Verwijder vóór het vervolgen van de procedure potentiële contaminatie met genomisch DNA door behandeling met DNase I, gevolgd door het gebruik van een commercieel verkrijgbare kit voor RNA-zuivering. Voltooi de kitprocedure door aan te vullen tot een volume van 60 µL.

Bepaal tot slot de RNA-concentratie en evalueer de integriteit van het RNA door middel van behandeling met glyoxal, monstering van de loading dye en gelanalyse voorafgaand aan de microarray-hybridisatie. Met behulp van conventionele methoden wordt het gezuiverde RNA omgezet in complementair DNA, dat met een commercieel verkrijgbare kit wordt gezuiverd van het afgebroken template en wordt opgevuld tot een volume van 60 µL. Start de microarray-hybridisatie door de microarray-slides te blokkeren met gesoniceerd zalmsperma-DNA. Spoel de geblokkeerde slides na een uur af met dubbel gedestilleerd water en centrifugeer deze.

Droog de coupes in conische buizen van 50 milliliter die zijn bekleed met een Kimwipe. Bereid vervolgens een 2x vormamide-gebaseerde hybridisatiebuffer. Warm deze eerst 10 minuten lang op tot 55 °C om de kristallen volledig op te lossen.

Centrifugeer het vervolgens gedurende één minuut bij 10.000 gs. Meng daarna 25 µL CD NA met 25 µL hybridisatiebuffer en tik het mengsel voorzichtig aan. Voer nu een korte spin uit van het mengsel en incubeer dit gedurende 10 minuten bij 80 °C.

Pipetteer na de incubatie voorzichtig de gehele CDNA-monster op de microarray-dia zonder de dia aan te raken, om het monster gelijkmatig over de microarray-dia te verspreiden. Plaats voorzichtig een dekglas op de dia met behulp van een injectienaald; trek de naald iets terug voordat het dekglas volledig is neergedaald en laat het dekglas vervolgens met de naald opnieuw voorzichtig op zijn plaats vallen.

Deze techniek minimaliseert de vorming van luchtbellen. Plaats de objectglas nu horizontaal in een conische buis van 50 milliliter, voeg 50 µL dubbel gedestilleerd water toe onder het objectglas en laat dit een nacht incuberen bij 37 °C. De volgende dag wordt er kort na het wassen van het objectglas een tweede hybridisatie uitgevoerd.

Meerdere keren in SSC wordt de tweede buffer, die lichtgevoelige capturereagentia en een Antifa-reagens bevat, aangebracht met dezelfde techniek, gevolgd door een korte incubatie, meer wasstappen en drogen. De slide kan vervolgens worden gescand. Afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met de gratis software met open source magic tool.

Maak kortstondig onder het tabblad project een nieuw project aan en sla dit op onder het tabblad build expression profile, selecteer 'load image pair' en selecteer het rode afbeeldingsbestand als rood en het groene afbeeldingsbestand als groen. Selecteer vervolgens het tabblad build expression profile. Kies 'load gene list' om een genenlijstbestand van C. elegans, verkregen van de GCAT-website, te uploaden om de microarray-afbeelding te adresseren en te rasteren.

Selecteer het tabblad 'build expression profile' en de optie 'create edit grid'. Bewerk nu het raster. Stel het dialoogvenster in door 48 in te voeren voor het aantal rasters, 22 rijen en 22 kolommen per raster, en kies ervoor om de posities van links naar rechts en van boven naar beneden te nummeren.

Verhoog het contrastpercentage en zoom in op het raster totdat de individuele spots gemakkelijk te onderscheiden zijn. Maak de rasters door in het linkerpaneel de optie voor de spot linksboven te selecteren en vervolgens op het midden van de spot linksboven te klikken, gevolgd door de spot rechtsboven en de onderste rij op raster één. Herhaal deze procedure voor elk van de 48 rasters, waarbij u van links naar rechts en van boven naar beneden werkt.

Sla het resultaat vervolgens op door het tabblad 'file' te selecteren en te kiezen voor 'save current grid as' zodra het is opgeslagen. Selecteer het tabblad 'finished' om alle niet-relevante spots uit de analyse te verwijderen. Open het tabblad 'build expression profile' en selecteer onder de optie 'addressing gridding' de optie 'spot flagging'.

Markeer nu eventuele strepen of achtergrondfluorescentie en sla dit op door 'save current flags' te selecteren. Ga vervolgens naar het tabblad 'file', waar de gemarkeerde bestanden gesegmenteerd moeten worden. Analyseer tot slot de genen die zijn geïnduceerd of onderdrukt door een specifieke factor door onder het tabblad 'expression' op 'explore' te klikken.

Stel in het dialoogvenster 'Exploring' de criteria in voor het matchen van specifieke genen. Het aantal tweevoudige toenames of afnames in expressie. De intensiteit wordt aangeduid als x en de waarde van X vormt het criterium voor de verandering in expressie.

X wordt ingevoerd als maximale waarde groter dan X voor geïnduceerde genen en minimale waarde kleiner dan x voor gerepresseerde genen. In dit experiment wordt een dye swap-controle uitgevoerd; de twee onafhankelijke isolaties van totaal RNA uit larven van stadium drie en stadium vier worden gehybridiseerd als groen mutant versus rood wild type, terwijl rood mutant versus groen wild type wordt gebruikt om veranderingen in genexpressie te bevestigen. Voer drie onafhankelijke isolaties van totaal RNA uit met dezelfde procedure, synthetiseer cDNA met een commercieel verkrijgbare kit, en voer voor elk cDNA-monster real-time PCR uit in triplikaat met drie housekeeping-genen als controles. Ter demonstratie worden de volgende resultaten van genexpressie onderzocht die zijn geïnduceerd in VSM one.

AK 1468-mutanten zijn een nematodenstam die wordt gekenmerkt door verhoogde synaptische activiteit. Voorafgaand aan de microarray-analyse wordt de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA gecontroleerd met gelelektroforese. De aanwezigheid van twee intacte ribosomale subunits voor en na de DNase I-behandeling is indicatief voor een goed RNA-monster. In de microarray wordt wild-type cDNA rood gelabeld en VSM-1-mutant cDNA groen gelabeld. In één van de 48 grids die per microarray worden geanalyseerd, stelt elk klein vierkantje een enkel geprint oligonucleotide voor; in elke array is elk uniek oligonucleotide vertegenwoordigd.

Nadat microarray-analyse van transcripten geïsoleerd uit stadium vier larven aantoont dat genen die coderen voor de belangrijkste spermaproteïnen (major sperm proteins) of MSP geïnduceerd zijn in VSM one-mutanten, onthult microarray-analyse van stadium drie larven eveneens expressieveranderingen binnen dezelfde genfamilie in de mutant. De voorspellingen uit de microarray, getoetst via real-time PCR-analyse, laten zien dat één lid van de MSP-genfamilie, MSP 32, geïnduceerd is in de VSM one-mutanten. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie replica's van real-time PCR uit dezelfde RNA-collectie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het gebruik van bioinformatische tools voor genoombrede analyse, zeker gezien de vele open-source bioinformatica-softwareprogramma's die beschikbaar zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.