Gericht Ion Beam Frezen en Scanning Electron Microscopy van hersenweefsel

Het doel van deze procedure is om seriële beelden te verzamelen van een specifiek gebied van hersenweefsel met behulp van een gefocuste ionenbundel en een scanningelektronenmicroscoop. Dit wordt bereikt door het brein eerst in plakjes te snijden, die vervolgens worden gekleurd en in hars worden ingebed. De tweede stap is om het interessegebied uit de ingebedde hersensectie te snijden en dit te monteren op een blanco harsblok.

De derde stap is het trimmen van het harsblok met een ultramicrotoom en het gebruik van de ionenbundel van de microscoop om uitsluitend het gebied te isoleren dat moet worden afgebeeld. De laatste stap is het serieel afbeelden van een zijvlak van het harsblok door de ionenbundel te gebruiken om herhaaldelijk dunne lagen te verwijderen voordat elke afbeelding wordt gemaakt. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die seriële beelden tonen door een gebied van interesse.

De beeldserie wordt automatisch verzameld en de dataset bevat doorgaans isotrope voxels, zodat de beeldstructuren vanuit elke hoek in de stack kunnen worden bekeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals seriële sectie transmissie-elektronenmicroscopie, is dat er een veel hogere Z-resolutie kan worden bereikt. En vergeleken met elektronentomografie is het mogelijk om veel grotere volumes af te beelden met een optimale resolutie voor in hars ingebedde monsters.

De procedure begint met het disseceren van het gefixeerde brein van een geanestheseerde, geperfuseerde rat. Bed het brein in warm 5% aeros in een plastic vorm en oriënteer het brein onder de juiste hoek voordat het aeros stolt. Monteer het aerosblok met het brein erin op een monsterhouder met behulp van een vibrato-slice. Maak coronale coupes van 80 micron en snijd zoveel coupes als nodig is om het interessegebied op te nemen.

Plaats de monsters vervolgens in glazen isolatiebuisjes van 20 milliliter. Plaats maximaal 10 secties per buisje. Spoel de monsters drie keer gedurende vijf minuten in 0,1 molair K coate buffer.

Kleur de monsters vervolgens gedurende 30 minuten met 1,5% kaliumcyanide en 1% osmiumtetroxide in 0,1 molar K coate buffer. Vervolg de kleuring van de monsters met 1% osmiumtetroxide in 0,1 molar K coate buffer gedurende 30 minuten. Spoel daarna eenmaal gedurende drie minuten met dubbel gedestilleerd water en kleur vervolgens gedurende 30 minuten met 1% al-acetaat in dubbel gedestilleerd water.

Spoel de coupes vervolgens vijf minuten in dubbel gedestilleerd water en dehydrateer ze daarna in een graduele alcoholserie, waarbij elke stap twee minuten duurt. De volgende stap is het inbedden van de coupes in toenemende concentraties Duran-hars gemengd met alcohol, met intervallen van 30 minuten tussen de wissels. Begin met een verhouding van 50:50 ethanol-hars, gevolgd door 30:70, vervolgens 10:90 en plaats de coupes tot slot 30 minuten in 100% hars.

Vervang vervolgens het medium door 100% verse duran-hars. Agiteer gedurende één uur langzaam op de rolmixer. Plaats na het inbedden de secties met een houten cocktailstokje op glazen microscopielaampjes die vooraf zijn gecoat met mallenscheidingsmiddelen.

Plaats zoveel mogelijk secties op de objectglazen, maar zorg ervoor dat de glazen niet te vol worden. Zorg er ook voor dat er een identiteitslabel tussen de objectglazen wordt geplaatst. Plaats de objectglazen gedurende 24 uur in een oven bij 65 °C.

Verwijder de volgende dag de monsters uit de oven. Duw voorzichtig een scheermesje tussen de glazen microscopische objectglazen en verwijder de harslaag met de monsters tussen de glaasjes door de harslaag met uw vingers vast te houden. Was het monster voorzichtig onder stromend water.

Om eventuele lossingsmiddelen van de mal te verwijderen, plaatst u het monster onder een dissectiemicroscoop met doorstrijkingsverlichting en een objectief met lage vergroting. Markeer het interessegebied met een fijne naald. Gebruik een scheermesje om een klein vierkant van drie millimeter bij drie millimeter rondom het interessegebied uit te snijden.

Gebruik acryllieme om het kleine harsblokje aan de bovenzijde van een blanco harsblok te bevestigen. Klem het blok vervolgens in de houder van de ultramicrotoom. Gebruik een scheermesje, terwijl u door de gekoppelde stereomicroscoop kijkt, om rond het interessegebied weg te snijden totdat er slechts een kleine piramide van materiaal overblijft.

Snijd de rand van het blok dicht bij het interessegebied onder een hoek ten opzichte van het bovenoppervlak van het blok, met behulp van een glazen mes vastgezet op de ultramicrotoom. Trim het blok verder zodat het interessegebied nauwkeurig kan worden gelokaliseerd ten opzichte van de afmetingen van het blokoppervlak. Verwijder het blok uit de ultramicrotoom en plaats het onder een transmissielichtmicroscoop.

Fotografeer het gebied van interesse. Gebruik een juwelierszaag om het getrimde blok met koolstofverf weg te snijden van de resterende harsstomp. Bevestig het losgekoppelde SA-blok op een SEM-monsterhouder en oriënteer het zodanig dat de zijde die gefotografeerd moet worden naar de buitenste rand is gericht.

Nadat de lijm is gedroogd, brengt u de preparatie over naar een sputter- en vacuümevaporatiesysteem en coatet u het blok met een dunne gouden laag van meer dan 20 nanometers. Het in hars ingebedde weefselblok is nu klaar om gefotografeerd te worden in de gefocuste ionenbundel-scanningelektronenmicroscoop. Plaats het monster in de houder in de microscoop bij een lage vergroting en oriënteer het blok met behulp van secundaire elektronenbeeldvorming zodanig dat het interessegebied en de zijde van het blok die gefotografeerd moet worden, naar voren zijn gericht.

De operator oriënteert het blok zodanig dat het vlak dat moet worden afgebeeld parallel aan de freesstraal ligt. Dit resulteert erin dat de elektronenstraal onder een hoek van 54 graden ten opzichte van dit vlak wordt georiënteerd, met gebruik van een ionenbundelstroom van 13 tot 27 nano amps bij 30 kilovolts.

Verwijder een smalle band hars van de voorzijde van het gebied dat moet worden afgebeeld. Schakel vervolgens over naar de modus voor terugverstrooiingsbeeldvorming om het gefreesde vlak te bekijken dat boven het interessegebied ligt. Lokaliseer, aan de hand van de eerder gemaakte referentieafbeelding uit de lichtmicroscopie en de afbeelding van het gefreesde vlak, het exacte gebied op het blok dat moet worden gefreesd en afgebeeld met behulp van het gasinjectiesysteem van de microscoop.

Breng een beschermende laag koolstof of metaal van ongeveer één micron dik aan op het oppervlak van het blok boven het gebied van interesse met een stroomsterkte van 700 picoamps. Frees tot slot het gebied van het blok uit waarin de uiteindelijke beelden zullen worden opgenomen. Laat de freesstraal dit beeldvlak volledig frezen totdat er geen freesartefacten meer op het vlak zichtbaar zijn.

Selecteer de microscoopinstellingen voor seriële beeldvorming van het oppervlak. Typische parameters zijn voltages tussen 1,2 en 2 kV met pixelgroottes tussen 4 en 20 nm. De verblijftijd per pixel moet ongeveer 10 µs zijn, zodat de totale tijd om het oppervlak te frezen en één beeld te verkrijgen minder dan twee minuten bedraagt.

Laat de microscoop minimaal twee uur rusten om eventuele thermische veranderingen op te vangen. Om deze te dissiperen, start u het frees- en beeldvormingsproces om seriële beelden van het interessegebied te verkrijgen. Deze figuur toont de reverse-contrast backscattered image van het blokoppervlak, waarop de ultrastructuur binnen een regio van de wrap-brain te zien is.

Alle membranen zijn zichtbaar, evenals grote macromoleculaire structuren. Deze figuur is samengesteld uit in totaal 1.600 beelden, verzameld met een tussenruimte van vijf nanometer, wat resulteert in een beeldstack met isotrope voxels. Deze stack kan in elk vlak worden afgebeeld met dezelfde resolutie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u hersenweefsel moet prepareren voor seriële beeldvorming met de focused ion beam scanning elektronenmicroscoop.