Associated Chromosoom Trap voor het vaststellen van lange afstand DNA-interacties

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontdekken en identificeren van DNA-partners met een associatie over lange afstand. Dit wordt bereikt door fixatie, cellyse en digestie van DNA met het eerste restrictie-enzym, gevolgd door ligatie om een chimeer DNA te creëren dat bestaat uit segmenten van de twee geassocieerde genen. Vervolgens worden linkers toegevoegd aan het chimere DNA na de tweede restrictiedigestie. Om de amplificatie te vergemakkelijken, wordt er daarna PCR-amplificatie uitgevoerd met behulp van primers die specifiek zijn voor de linker en het bait-DNA, om voldoende hoeveelheden van de geassocieerde DNA-fragmenten te verkrijgen. Op basis van sequentieanalyse van de geamplificeerde DNA-fragmenten worden resultaten verkregen die de DNA-partners met een associatie over lange afstand met het bait-DNA aantonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals chromosome confirmation capture of 3C, is dat A-C-T-S-A effectief kan worden gebruikt om een onbekende, geassocieerde DNA-partner over lange afstand te identificeren. Terwijl 3C is ontwikkeld voor de verificatie van uitsluitend reeds vermoedde interacties. Begin dit protocol door menselijke cellen te kweken in een incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 °C totdat ze 80 tot 90% confluent zijn.

Voor deze demonstratie worden humane promyelocytaire acute leukemiecellen gebruikt. Verzamel de cellen door ze in een 50 milliliter NOC-buis te gieten en centrifugeer deze gedurende 15 minuten bij 1200 RPM. Verwijder na centrifugatie het medium door aspiratie.

Voeg vijf milliliters kweekmedium toe om de celpellets te resuspenderen. Na het tellen van de cellen met een hemocytometer, neem ongeveer 1 × 10⁷ cellen en vul dit aan tot een volume van 40 milliliters met RPMI 1640-medium dat 10% FBS bevat. Voeg vervolgens 1,7 milliliters 37% formaldehyde toe om het verdunde chromatine te fixeren.

Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder zachte schudding. Stop na incubatie de reactie door toevoeging van 2,4 milliliters twee molar glycine. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 15 minuten bij 1200 RPM en vier degrees celsius.

Nadat het supernatant is verwijderd, wordt de pellet één keer gewassen met 40 milliliters ijskoud PBS, waarna het monster wordt gecentrifugeerd om de gewassen celpellet terug te winnen. Resuspendeer de resulterende pellet in 40 milliliters ijskoud lysisbuffer met vers toegevoegde protease-remmers en 0.1 millimolar PMSF en incubeer het monster in een koudekamer onder rotatie gedurende 90 minuten. Centrifugeer het monster tot slot bij 2, 500 RPM gedurende 15 minuten, verwijder het supernatant en verzamel de geïsoleerde kernen. Resuspendeer de kernen in 0.5 milliliters van één XNEB buffer drie en voeg 15 microliters 10%SDS toe.

Incubeer het monster gedurende één uur bij 37 °C onder schudding. Voeg vervolgens 45 µL 20% Triton X 100 toe om het SDS te sequesteren en incubeer opnieuw gedurende één uur bij 37 °C onder schudding en verdeel in aliquoten van 1 × 10⁶. De kernen, ongeveer 15 µg, worden gebruikt voor restrictie-enzymdigestie in 55 µL kernoplossing.

Voeg 433 µL van een 1X NEB-buffer 3 en 12 µL BglII toe. Om een totaal digestievolume van 500 µL te verkrijgen, wordt de reactie overnight geïncubeerd bij 37 °C. Inactiveer de volgende dag het restrictie-enzym door 95 µL 10% SDS toe te voegen en denatureer het enzym door dit 20 minuten lang te verhitten bij 65 °C.

Voeg in een waterbad zeven milliliter van een 1x ligatiebuffer en 360 microliters van 20% Triton X 100 toe. Incubeer het monster gedurende één uur bij 37 °C. Verlaag de temperatuur naar 16 °C en voeg 50 microliters van 400 units per microliter toe.

Voeg T4 DNA-ligase toe. Laat de ligatiereactie vier uur incuberen bij 16 °C en vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur. Wanneer de ligatie is voltooid, voegt u 300 µg proteinase K toe en laat u dit overnight incuberen bij 65 °C.

Voeg vervolgens vijf µg RNAA toe en incubeer dit 30 minuten bij 37 °C. Zuiver het DNA middels fenol-chloroformextractie en precipiteer het DNA in isopropanol; los het geprecipiteerde DNA op in 150 µL steriel gedestilleerd water. Om linkers aan het chimere DNA toe te voegen, wordt het DNA eerst gedigereerd door twee µg gezuiverd DNA te incuberen met vijf units MspI bij 37 °C gedurende vier tot zes uur. Inactiveer na de digestie MspI 10 minuten bij 65 °C.

Precipiteer vervolgens het DNA in ethanol met één µL glycogeen van 5 mg/mL. Los het resulterende DNA-pellet op in 50 µL steriel gedestilleerd water. Meng daarna 50 µL MSP1-behandeld DNA met twee µL van een 20 µM linker-oligonucleotide L en één µL van een 20 µM oligonucleotide S, voeg vervolgens één µL steriel gedestilleerd water en zes µL 10X T4 DNA-ligasebuffer toe.

Bedek het mengsel met vloeibare was. Denatureer de oligonucleotiden bij 50 °C gedurende één minuut en laat het geleidelijk afkoelen tot 10 °C met een gradiënt van 0,5 °C per minuut. Voeg met behulp van een thermocycler één µL T4 DNA-ligase (400 units per µL) toe en incubeer de reactie gedurende de nacht bij 15 °C.

Zuiver de volgende dag het DNA met geligeerde linkers met een kaya quick PCR-zuiveringskit en elueer dit in 50 µL steriel gedestilleerd water. Kies vervolgens een primer voor het specifieke DNA-gebied dat onderzocht wordt op long-range interacties. In dit voorbeeld wordt Abel gebruikt als de primer of het lokaas.

Bereid het gezuiverde DNA voor voor de eerste ronde PCR door één microliter van het gezuiverde DNA te combineren met één microliter van 20 micromolar able one-specifieke primer, 46 56, en één microliter van 20 micromolar linker-specifieke primer 29 63. Voeg vervolgens drie microliters toe van de 3x ClinTech DNA-polymerase one-cocktail die vooraf is gemengd met 32 P-D-C-T-P volgens het schriftelijke protocol, gevolgd door drie microliters steriel gedestilleerd water. Voer de PCR-amplificatie uit met de hot start PCR-thermische cyclus zoals beschreven in het schriftelijke protocol nadat de PCR-cyclus is voltooid.

Zuiver de PCR-producten van de eerste ronde met een kaya quick PCR-zuiveringskit. Elueer in 30 µL steriel gedestilleerd water. Gebruik één µL van het 100 keer verdunde eerste PCR-product om een tweede ronde PCR uit te voeren met nested primers door één µL van een 20 µM able one-specifieke primer, 46 26, en één µL van een 20 µM linker-specifieke primer, 29 61, toe te voegen.

Voeg vervolgens drie µL van 3x ClinTech, DNA-polymerase, one cocktail en drie µL steriel gedestilleerd water toe. Voer de tweede PCR-ronde uit met een thermische cyclusschema van 25 cycli bestaande uit 95 °C gedurende 20 seconden, 67 °C gedurende 40 seconden en 72 °C gedurende één minuut, gevolgd door een extensiestap bij 72 °C gedurende vijf minuten.

Visualiseer de PCR-producten door een 5%urea page-gel te draaien en scan vervolgens het belichte scherm in een phospho imager. Elke PCR-band kan uit de gel worden teruggewonnen door de gelstripjes op te lossen in een eppendorfbuisje met 60 µL steriel gedestilleerd water en vijf minuten te incuberen bij 95 °C. Centrifugeer de opgeloste gelproducten kortstondig bij 10.000 RPM gedurende 10 seconden.

Om alle monsters te verzamelen: neem één µL af om te gebruiken als DNA-template voor het uitvoeren van PCR met de prime repair. 29 61 46 26.

Met gebruik van dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven, kan na zuivering en sequenering een analyse worden uitgevoerd met een online tool om de chromosomale locatie te bepalen. Klik zodra u op de bio-informaticawebsite van het genoom bent, op blatt om een nieuw venster te openen en plak de DNA-sequentie. Na het verzenden van de DNA-sequentie verschijnen de BLATT-zoekresultaten.

Klik op de browser bij de hit met 100% identity om de locatie van de DNA-sequentie te onthullen. De able one regio werd als lokaas gebruikt om de long-range DNA-interacties ervan te bepalen. Twee BGL II-sites en één Bam HI-site werden gekozen voor de 3C-assay; in de tweede ronde van PCR werd primer-set 46 26 29 61 gebruikt om able M1 te amplificeren, 46 30 29 61 werd gebruikt voor able M2 en 46 36 29 61 werd gebruikt voor able M3.

Een typisch gelpatroon onthult één tot meerdere banden, zoals hier wordt getoond voor able M1, able M twee en able M drie. De DNA-sequentie van kloon able M1 wordt getoond om aan te tonen dat elk fragment uit een A CT-assay bestaat uit twee gecombineerde DNA-segmenten. Eén segment is afgeleid van de bait-DNA-regio, terwijl het tweede segment afkomstig is van de geassocieerde partner.

De segmenten worden aan elkaar gekoppeld via de eerste restrictie-enzymherkenningssequentie. De tweede enzymherkenningssequentie bevindt zich aan het einde van de bijbehorende partnersequentie. Het gekloneerde M1-fragment bevat DNA uit de regio van ABLE one op chromosoom 9q32.4, en de bijbehorende partner bevindt zich op chromosoom 3p3, wat werd geïdentificeerd als proc two.

Op dezelfde manier was de geassocieerde partner van able M twee gelokaliseerd op chromosoom vijf Q 21.1, terwijl kloon able M drie werd geïdentificeerd als een intrachromosomale associatie nabij de ABLE een locus, in tegenstelling tot drie C assays. De in deze video beschreven methodologie selecteert op de meest voorkomende lange-afstand interacties. Door echter het aantal PCR R cycli te verhogen, is het mogelijk om ook aanvullende, minder frequente associaties te identificeren. Met gebruik van de imprinting and control region of ICR bij de IGF twee H 19 locus als bait DNA in muis fibroblastcellen, werden in de eerste en tweede PCR-rondes bij de A CT assay verschillende cyclingschema's toegepast.

De A CT-assay kan ook worden gebruikt om verschillen in de nucleaire architectuur en lange-afstandsinteracties tussen normale cellen en kankercellen te identificeren. Normaal colonweefsel en colonkankerweefsel werden gehomogeniseerd en de A CT-assay werd uitgevoerd volgens de hier beschreven procedures. Hier wordt de DNA-structuur van de ICR-regio op de IGF two H 19-locus en het IGF two-gen dpn getoond.

Twee locaties voor de A CT-assay zijn gemarkeerd; de gelabelde primers die worden gebruikt in de tweede PCR-ronde zijn aangeduid met pijlen en nummers in verschillende kleuren. Het gelpatroon van de A CT-assay representeert de PCR-resultaten waarbij primer 29 61 is gebruikt in combinatie met primerpaar 41, 61, 41 63, 51 45, en 51 51. Unieke banden die alleen in normaal colonweefsel voorkomen, zijn gemarkeerd met gele pijlen, en de banden die alleen in colonkankerreefsel verschenen na de ontwikkeling, zijn gemarkeerd met rode pijlen.

Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het veld van de moleculaire biologie om de nucleaire architectuur en genregulatie in drie dimensies te verkennen.