High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch
28 juni 2012
Genoomassemblages op basis van massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn doorgaans sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan genoomassemblages potentieel verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoompreparatie, fluorescentie in situ hybridisatie en imaging die de doorvoer van de ontwikkeling van de fysieke kaart aanzienlijk verhogen.
Het algemene doel van deze procedure is om DNA-probes in kaart te brengen op polytane chromosomen van muggen met behulp van een chromosoompreparaat onder hoge druk, gevolgd door geautomatiseerde fluorescentie in situ hybridisatie en geautomatiseerde beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst polytane chromosoomspreidingen te maken met een methode onder hoge druk. De volgende stap van de procedure is het bereiden van fluorescente probes door genomisch DNA te labelen met het fluorochroom via een nick-translatieprotocol.
De derde stap is het uitvoeren van fluorescentie-in-situ-hybridisatie met behulp van geautomatiseerde systeem voor het kleuren van coupes. De laatste stap is het scannen en fotograferen van de gelabelde chromosomen met een automatisch fluorescentie-beeldvormingssysteem. Uiteindelijk kunnen de beelden de lokalisatie van een fluorescent gelabelde DNA-sonde op het polychrome chromosoom tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals een standaard handmatig in situ hybridisatieprotocol, is dat dit fysieke mappingprotocol met de hoogste doorvoer consistenter resultaten oplevert en de actieve werktijd drastcznie vermindert. Dit protocol begint bij het dissecteren van vrouwtjes van half gravity en oly ongeveer 25 uur na het bloedvoedsel om hun eierstokken te verzamelen wanneer deze zich in Christopher's stadium drie bevinden. In dit stadium moet het transparante gebied met voedercellen binnen de follikels een ronde vorm hebben; verzamel de eierstokken van vijf vrouwtjes en fixeer deze in 500 µL vers bereide gemodificeerde carnoise-oplossing.
Deze kunnen vervolgens tot 24 uur bij kamertemperatuur worden bewaard, of langer bij -20 °C. Bereid vervolgens, vlak voordat de preparaten voor de dissectie van de eierstokken worden gemaakt, een carnoise-oplossing en 50% propionzuur. Plaats elk paar eierstokken in een druppel verse carnoise-oplossing op een stofvrije objectglas onder een dissectiemicroscoop.
Splits de eierstokken met de dissectenaald. Breng alle stukjes eierstok over naar zes schone objectglazen met 50% propionzuur. Scheid de follikels van elkaar met behulp van dissectenaalden.
Veeg vervolgens eventuele resterende weefsels weg met een papieren handdoek. Voeg nog een druppel 50% propionzuur toe en wacht drie tot vijf minuten. Legenda: het laten rusten van de follikels in 50% propionzuur gedurende drie tot vijf minuten verbetert de chromosoomspreiding aanzienlijk.
Breng vervolgens een dekglas aan en wacht nog een minuut om de kernen te laten verspreiden. Wikkel de objectglas in filterpapier en plastic. Stel een Dremel in op een snelheid tussen de 3.000 en 5.000 RPM en draai gedurende ongeveer één minuut voorzichtig met een draaiende Dremel-top over het dekglas.
Bevestig de kwaliteit van de verspreiding met een fascontrastmicroscoop en gebruik de dremel indien nodig langer om de chromosomen af te platten. Plaats een tweede dekglas naast het eerste en klem de dekglazen vervolgens tussen twee microscopen. Wikkel de objectglazen daarna in een plastic vel en filterpapier; plaats de ingepakte glazen in een bankschroef om ze samen te persen met een kracht tussen 85 en 120 inch-pounds.
Nadat de chromosomen op alle zes de objectglaasjes zijn platgemaakt, worden de glaasjes uitgewikkeld en worden de extra glaasjes verwijderd om de chromosomen verder plat te maken. Incubeer de glaasjes 10 tot 15 minuten bij 55 °C in een denaturatie-hybridisatiesysteem voor objectglaasjes. Doop vervolgens een objectglas gedurende ten minste 15 seconden in vloeibare stikstof of totdat het borrelen is gestopt.
Verwijder vervolgens snel het dekglas met een scheermesje en plaats het preparaat onmiddellijk gedurende vijf minuten in koud 50% ethanol. Herhaal dit proces opeenvolgend voor elk preparaat. Dehydrateer de preparaten in baden van 70%, 90% en 100% ethanol.
Dompel ze vijf minuten in elk bad. Ten slotte, nadat de coupes aan de lucht zijn gedroogd, zijn ze klaar voor de kleuring. Een geautomatiseerd apparaat voert de meeste stappen van de procedure uit, behalve de labeling van de probe.
Bereid dus, voorafgaand aan het laden van het apparaat, de fluorescente probe voor door het back-DNA te labelen met het fluorochroom met behulp van een commercieel NIC-translatieprotocol. Nadat de probe is voorbereid, worden de dia's en reagentia in het geautomatiseerde dia-kleuringssysteem geladen en wordt het systeem geprogrammeerd om de volgende stappen uit te voeren. Lever eerst 800 µL 1x PBS voor 20 minuten.
Ten tweede worden de objectglazen drooggeblazen. Ten derde worden de objectglazen één minuut gefixeerd met 450 µL 4% formaline in 1x PBS. Was de objectglazen vervolgens twee keer gedurende één seconde en daarna gedurende twee minuten met 100% ethanol.
Blaas de slides na het ethanolbad opnieuw droog. Verwarm de slides vervolgens gedurende twee minuten op 45 °C om bellenvorming te voorkomen. Breng daarna 20 µL van de DNA-sonde aan, gevolgd door een druppel minerale olie en een dekglas; denatureer vervolgens de chromosomen gedurende 10 minuten op 90 °C.
Laat de coupes vervolgens hybridiseren bij 42 °C gedurende 14 uur. Voer na de hybridisatie stringenswasbeurten uit van twee minuten bij 42 °C, gevolgd door vier opeenvolgende applicaties van 2X SSC gedurende één seconde en droging. Breng daarna twee keer 800 µL 0,4X SSC aan bij 42 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door nog één wasbeurt en 2X SSC bij 25 °C gedurende 10 minuten.
Breng nu de kleurstof aan: 50 µL YO-YO-1, gevolgd door minerale olie en dekglasjes. Incubeer de preparaten gedurende 10 minuten bij 25 °C. Verwijder vervolgens de dekglasjes.
Was de preparaten vier keer gedurende één seconde per wasbeurt in twee XSSC en blaas de preparaten droog. Breng tot slot 15 µL prolonged gold anti fade-reagens aan op elk preparaat en bevestig nieuwe dekglasjes. Zet het Accord plus automatische scansysteem aan, beginnend met de Olympus U-R-F-L-T voeding voor een halogeenlamp.
Vervolgens de computer en tot slot de microscoop met camera-accessoire. Open nu eerst het duet-softwarepakket en stel een 10 x pre-scan in. Klik op de online-knop, voer een nieuw case-ID in en wijs een slide-ID toe.
Klik op het punt met het label bf. Dit is de optie voor helderveldmicroscopie. Selecteer als scanoptie de 10 x pre-scan.
Selecteer 2.500 x cirkel, 10.000 x cirkel of rechthoek. Klik op 'set' en 'run'. Volg vervolgens de aanwijzingen om het scannen correct af te stellen en klik daarna op 'finish'.
Druk om de scan te starten op het hoofdtabblad om terug te gaan naar het hoofdscherm. Klik nu op de knop voor offline modus, zoek het toegewezen case-ID en slide-ID, en klik op offline.
Scan het zwarte kader in het gebied linksboven. Klik op een pijl en selecteer 10 x pre-scan. Gebruik de pijlen om door de gescande beelden te navigeren nadat een interessant beeld is gevonden.
Dubbelklik op het scherm in het midden van het doelgebied en druk op 'snap'. Hiermee wordt een afbeelding gemarkeerd voor latere vastlegging, nadat alle doelgebieden zijn geselecteerd. Klik met de rechtermuisknop op elke afbeelding, klik op 'classify', selecteer '10 x pre-scan' en selecteer 'polytan'.
Keer terug naar het hoofdmenu en stel de 40 x pre-scan in. Selecteer opnieuw online en selecteer een objectglas. Wijzig BF naar ffl en wijzig de taaknaam naar revisit dash X 40 dash rg.
Wijzig de sectie direct onder de laatste instelling om dash all opnieuw te bezoeken. Voer vervolgens het programma uit en volg de aanwijzingen. Om de automatisering in te stellen, klikt u op de knop start matching views om de 10 x en 40 x afbeeldingen te matchen.
Klik op finish om de scan te starten. Klik na voltooiing op classify en bekijk de afbeeldingen. Preparaten van polytane chromosomen uit nurse-cellen van de eierstok van vrouwelijke anomaly Gambia werden gemaakt met behulp van de hogedruktechniek.
Deze methode beschadigt of verandert de meeste chromosoomstructuren niet. Het vlakt gebogen chromosomen af en onthult zo verborgen fijne banden die op reguliere preparaten niet zichtbaar zijn. Het chromosoom werd gesondeerd met DNA-klonen verkregen uit de anomaly S Gambia nd Tam back-bibliotheek.
De bibliotheek werd gegenereerd uit mannelijke en vrouwelijke eerste-stadium larven van de anomaly S Gambia-plaagstam. Na deze procedure kan een geautomatiseerde high-throughput fysieke mapping worden uitgevoerd om de snelle ontwikkeling van chromosoomgebaseerde genoomassemblages te vergemakkelijken.
Overzicht
Deze studie presenteert een high-throughput protocol voor het mappen van DNA-probes op polytene chromosomen van muggen. Door gebruik te maken van chromosoompreparatie onder hoge druk en geautomatiseerde beeldvormingstechnieken, verhoogt deze methode de efficiëntie en consistentie van de ontwikkeling van fysieke kaarten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genomics
- Chromosoommapping
- Fluorescentie in situ hybridisatie
Achtergrond
- Genoomassemblages uit DNA-sequencing zijn vaak gefragmenteerd.
- Fysieke chromosoomkaarten kunnen de kwaliteit van genoomassemblages verbeteren.
- Innovatieve technieken kunnen de doorvoersnelheid bij fysieke mapping verhogen.
- Geautomatiseerde systemen kunnen de actieve tijd bij laboratoriumprocedures verminderen.
Doel van de studie
- Om een high-throughput protocol te ontwikkelen voor chromosoommapping.
- Om de effectiviteit van geautomatiseerde beeldvorming aan te tonen bij de ontwikkeling van fysieke kaarten.
- Om de consistentie van de resultaten te verbeteren in vergelijking met traditionele methoden.
Gebruikte methoden
- Chromosoompreparatie onder hoge druk vanuit eierstokken van muggen.
- Labeling van fluorescente probes met behulp van het nick-translatieprotocol.
- Geautomatiseerde fluorescentie in situ hybridisatie.
- Geautomatiseerde beeldvorming voor chromosoomlokalisatie.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol levert consistente chromosoompreparaten van hoge kwaliteit op.
- Geautomatiseerde systemen verminderen de tijd die nodig is voor fysieke mapping aanzienlijk.
- De afbeeldingen tonen effectief de lokalisatie van fluorescentie-gelabelde DNA-sondes.
- De methode verhoogt de doorvoer in vergelijking met handmatige protocollen.
Conclusies
- Dit high-throughput protocol is een aanzienlijke vooruitgang in chromosoommapping.
- Automatisering verbetert de efficiëntie en consistentie bij fysieke mapping.
- De gedemonstreerde technieken kunnen worden toegepast op andere genomische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Physicale chromosoommapping met een hoge doorvoer pakt een kritiek knelpunt in de kwaliteit van genoomassemblage aan, wat een directe impact heeft op downstream genomische analyses en evolutionaire studies. Door een snelle en consistente lokalisatie van DNA-probes mogelijk te maken, ondersteunt deze aanpak het verminderen van risico's bij targetvalidatie en verbetert het de voorspellende betrouwbaarheid in workflows voor vergelijkende genomica. De integratie van automatisering vermindert de actieve werktijd en verhoogt de reproduceerbaarheid, waardoor de methode een schaalbare capaciteit wordt voor grootschalige sequeneringsprojecten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de genomische architectuur te onderzoeken en de genlokalisatie ten opzichte van fenotypische kenmerken te verduidelijken.
- Operationele waarde: Vermindert ambiguïteit in genannotatie door contigs toe te wijzen aan specifieke chromosomale locaties.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het vertrouwen in de inferentie van genfuncties te vergroten via nauwkeurige fysieke mapping.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde chromosoompreparaten met een hoge resolutie die geschikt zijn voor reproduceerbare FISH-gebaseerde assays.
- Operationele waarde: Geautomatiseerde kleurings- en imagingsystemen verhogen de doorvoersnelheid en verminderen de variabiliteit bij de detectie van probelokalisatie.
- Assay-gereedheid: Genereert kwantificeerbare ruimtelijke resultaten die vergelijkingen tussen genetische varianten of experimentele condities mogelijk maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Faciliteert evolutionaire analyse en fylogenetische reconstructie door oriëntatie en locatie toe te wijzen aan sequencing-contigs.
- Relevantie voor preklinische modellen: Ondersteunt studies naar vectorcompetentie door vergelijkende genomica mogelijk te maken tussen ziekte-overbrengende en niet-overbrengende soorten.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Verbetert de kwaliteit van genoomannotaties, waardoor het aantal fout-positieven in pipelines voor targetidentificatie wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege genoomsequencing tot annotatie en comparatieve analyse, met name wanneer een fysieke kaartresolutie nodig is om assembly-gaten of misassemblies op te lossen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot genvolgorde, syntenie en chromosomale evolutie in ziekterelevante modellen.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde, geautomatiseerde FISH-workflows mogelijk voor high-throughput probe-validatie en lokalisatiescreening.
- Analytiek: Genereert ruimtelijke en op intensiteit gebaseerde read-outs die een kwantitatieve vergelijking van probe-binding over chromosomen of monsters mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt fysieke mapping met evolutionaire inferentie en biomarker-ontdekking in vergelijkende genomica-studies.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar, geautomatiseerd platform voor fysieke mapping dat toepasbaar is over meerdere soorten en projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in genannotatie en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de interpretatie van genomische gegevens.
- Operationele waarde: Levert standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door automatisering van de kleurings-, hybridisatie- en imagingstappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij targetselectie door de betrouwbaarheid van de genoomassemblage te verhogen en biologische valse sporen te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genomische targets mogelijk door verbeterde assemblagekwaliteit en evolutionair inzicht.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in chromosoompreparatie, FISH-protocollen en geautomatiseerde imaging-systemen.
- Afhankelijk van toegang tot instrumenten voor preparatie onder hoge druk, geautomatiseerde slide-kleurders en gemotoriseerde fluorescentiemicroscopen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor sonde-labeling, hybridisatiecondities en image-analyse-pipelines.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan optimalisatie van de stappen voor chromosoomspreiding en denaturatie vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van polytene chromosomen van hoge kwaliteit en de geschiktheid primair voor diptera-genomen met polytene stadia.
