iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

Het algemene doel van het volgende experiment is om een transcriptoombrede kaart van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit te verkrijgen met een resolutie op individueel nucleotide-niveau. Dit wordt bereikt door in een tweede stap levende cellen te bestralen met UV-licht om eiwitten en RNA in vivo covalent aan elkaar te crosslinken. Het RNA-bindende eiwit wordt onder stringente omstandigheden immunogezuiverd om de gecrosslinkte RNA-fragmenten terug te winnen.

Vervolgende reverse transcriptie genereert cDNA's die vaak worden afgekapt bij het gebonden peptide, waardoor de informatie over de positie van de cross-link binnen het RNA behouden blijft. Er worden resultaten verkregen die alle bindingsplaatsen binnen het transcriptoom tonen op basis van high-throughput sequencing van de cDNA-bibliotheek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de RNA-biologie, zoals hoe de interactie van verschillende RNA-bindende eiwitten de RNA-verwerking reguleert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we zowel de prestaties als de resolutie van onze transcriptoombrede kaarten van eiwit-RNA-interacties verhogen. Om te beginnen met de procedure van UV-cross-linking van weefselkweekcellen.

Verwijder het medium uit een plaat van 10 centimeter met healer-cellen. Voeg zes milliliters ijskoud PBS toe en plaats de platen op ijs. Eén plaat is voldoende voor drie experimenten.

Verwijder het deksel en bestraal de cellen. Zet de golflengte op 254 nanometers met 150 millijoules per centimeter squared en oogst de cellen door ze met een cell lifter van de platen af te schrapen. Breng twee milliliters cellensuspensie over naar elk van de drie microbuisjes om de cellen te pelletteren. Centrifugeer deze op maximale snelheid gedurende 10 seconden bij vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens de supernatant-snap, vries de celpellets in op droogijs en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Voeg 100 µL proteïne-DynaBeads per experiment toe aan een schone microcentrifugebuis. Gebruik proteïne G DynaBeads indien er gewerkt wordt met muizen- of geitenantilichamen.

Was de kraaltjes twee keer met lysisbuffer, die te vinden is in het bijbehorende schriftelijke protocol. Resuspendeer de kraaltjes in 100 µL lysisbuffer met twee tot 10 µg antilichaam. Rotateer de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 60 minuten.

Was de beads vervolgens drie keer met 900 µL lysisbuffer en laat ze in de laatste wasbeurt staan totdat u klaar bent om verder te gaan. Voor immunoprecipitatie van Thor-cellen op ijs: resuspendeer in 1 mL lysisbuffer en breng dit over naar een 1,5 mL microcentrifugebuis.

Bereid een verdunning van 1:500 van RNAs one voor. Voeg vervolgens 10 µL samen met 2 µL turbo DNAs toe aan het cellulysaat. Incubeer de monsters precies drie minuten bij 37 °C, terwijl ze worden geschud met 1.100 omwentelingen per minuut, en breng ze onmiddellijk over naar ijs.

Centrifuge de monsters vervolgens bij 4 °C en 22 000 ×g gedurende 20 minuten om het lysaat te klaren. Verzamel het supernatant zorgvuldig, waarbij ongeveer 50 µL lysaat bij het pellet wordt achtergelaten. Verwijder de wasbuffer en voeg vervolgens de voorbereide cellysaten toe. Laat de monsters twee uur roteren bij 4 °C.

Verwijder het SUP-agens en was de beads twee keer met 900 µL high salt buffer, zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Was de beads tot slot twee keer met 900 µL wasbuffer. Ga vervolgens over tot het defosforyleren en het toevoegen van een linker aan de 3'-uiteinden van het RNA.

Om de 5'-uiteinden van het RNA te labelen, werkend achter een plexiglas scherm. Verwijder het supernatant van de laatste wasstap van de linkerligatiereactie en resuspendeer de beads in 8 µL warme PNK-mix. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C.

Verwijder het warme PNK-mengsel en gebruik het opnieuw. Suspendeer de beads in 20 µL van een éénvoudig nieuw paginalaadbuffer. Incubeer het monster vervolgens op een thermomixer bij 70 °C gedurende 10 minuten.

Plaats het monster onmiddellijk op een magneet om de lege beads neer te slaan. Laad de monsters op een 4 tot 12% nieuwe SDS-PAGE gel volgens de instructies van de fabrikant.

Laad daarnaast vijf µL van een vooraf gekleurde eiwitlengtemarker. Laat de gel 50 minuten lopen bij 180 volt. Transfer de eiwit-RNA-complexen van de gel naar een nitrocellulosemembraan met behulp van het NOVA natte transferapparaat volgens de instructies van de fabrikant.

Spoel na de overdracht het membraan met PBS-buffer. Wikkel het membraan vervolgens in Saranwrap en stel het bloot aan film bij minus 80 graden Celsius. Voer belichtingen uit gedurende 30 minuten, één uur en een nacht.

Isoleer vervolgens de membraanregio volgens de eiwit-RNA-complexen uit de lage RNA-concentraties. Voer het experiment uit met de autoradiografie als masker. Win het RNA uit het membraan terug door middel van digestie met proteinase K en fenol-chloroformextractie.

Screvaer het RNA om met een van de AYP-primers om het cDNA te zuiveren via een gel. Meng zes µL cDNA-monster met zes µL twee keer TBE-urealadbuffer, vlak voordat de monsters op een gel worden geladen.

Verwarm de monsters drie minuten lang tot 80 °C. Laad de monsters vervolgens, samen met een marker voor laag moleculair gewicht, op een prefab 6% TBE-ureumgel. Laat de gel 40 minuten lopen bij 180 volt, zoals beschreven door de fabrikant, waarbij de bovenste kleurstof en de markeringen op de plastic gelondersteuning als leidraad voor de excisie worden gebruikt.

Snijd drie banden uit op 120 tot 200 nucleotiden, 85 tot 120 nucleotiden en 70 tot 85 nucleotiden. Houd er rekening mee dat de arc lip-primer en de L drie-sequentie samen 52 nucleotiden van de clip-sequentie beslaan. Voeg 400 µL TE toe en verbrijzel het gelstukje in kleine stukjes.

Incubeer de gelstukjes met behulp van de zuiger van een spuit van 1 ml gedurende twee uur bij 37 °C met schudden op 1.100 toeren per minuut. Plaats twee glazen voorfilters van 1 cm in een CoStar spinx-kolom. Draag het vloeibare deel van het monster over naar de kolom en centrifugeer dit één minuut op 13.000 toeren per minuut in een buisje van 1,5 ml.

Voeg 0,5 µL glyco blue en 40 µL natriumacetaat pH 5,5 toe. Meng vervolgens het monster. Voeg 1 mL 100% ethanol toe.

Meng opnieuw en laat het monster een nacht neerslaan bij -20 °C. Circulariseer vervolgens de CD NA-moleculen om de adaptorregio aan het 5'-uiteinde te koppelen. Lineariseer daarna opnieuw en voer een PCR-amplificatie uit volgens het bijbehorende schriftelijke protocol voorafgaand aan de sequencing van de eye clip-library; het succes van het experiment kan in twee stappen worden gemonitord.

De autoradiografie van het eiwit-RNA-complex na membraanoverdracht en het gelbeeld van de PCR-producten; in de autoradiografie van de monsters met een lage RNA-concentratie moet diffuse radioactiviteit zichtbaar zijn boven het molecuulgewicht van het eiwit. Voor monsters met een hoge RNA-concentratie is deze radioactiviteit sterker geconcentreerd nabij het molecuulgewicht van het eiwit. Wanneer er geen antilichaam wordt gebruikt bij de immunoprecipitatie, mag er geen signaal worden gedetecteerd.

Verdere belangrijke controles voor de specificiteit van de immunoprecipitatie omvatten het weglaten van UV-bestraling of het gebruik van cellen die het eiwit van belang niet tot expressie brengen. De gelafbeelding van de PCR-producten moet een groottebereik vertonen dat overeenkomt met de cDNA-fractie. Let op dat de PCR-primers, P3Celexa en P5Celexa, 76 extra nucleotiden toevoegen aan de grootte van het cDNA. Indien er geen antilichaam wordt gebruikt tijdens de immunoprecipitatie, mag er geen overeenkomstig PCR-product worden gedetecteerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elk van de 64 stappen kritisch is en met honderd procent nauwkeurigheid moet worden uitgevoerd. ICL-gegevens kunnen computationeel worden geïntegreerd met functionele assays op transcriptoombreed niveau. Dit kan bijvoorbeeld inzicht verschaffen in de positieafhankelijke regulatie van RNA-verwerking.

Voor de computationele data-analyse verwijzen wij graag naar onze recente publicaties in samenwerking met Nicholas KA van het European Bioinformatics Institute en bla zupan van de University of Liana. En nu is het tijd om met uw eigen experimenten te beginnen. Veel succes.