Techniek Biologisch-Based vaattransplantaten Met behulp van een Pulsatiele Bioreactor

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van biologisch gebaseerde vasculaire grafts met behulp van een pulserend bioreactorsysteem. Dit wordt bereikt door een biologisch afbreekbare scaffold te vervaardigen van een PGA-gaas waarop de cellen zullen groeien, en deze vervolgens te plaatsen in een bioreactorchamber. De scaffolds worden daarna bezaaid met gladde spiercellen, waarna de bioreactorchamber wordt afgesloten met een deksel voorzien van lucht- en voedingsbuissegels.

De bioreactor wordt vervolgens aangesloten op een flowsysteem om een pulserende stroom te leveren aan de vaten in de bioreactor. In de reactor groeien de cellen uit tot vaten die immunochemische, biochemische en mechanische tests doorstaan. De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van coronaire hartziekten, omdat deze techniek een veelbelovende benadering is voor het regenereren van implanteerbare vasculaire grafts met een kleine diameter voor arteriële bypass.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in vasculaire engineering, kan ze worden toegepast op andere organsystemen die onderhevig zijn aan cyclische fysiologische krachten. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn aan deze methode er moeite mee hebben. Er is veel oefening nodig om de vaardigheden volledig onder de knie te krijgen.

We kregen voor het eerst het idee voor deze aanpak toen we ons realiseerden hoe belangrijk het is om fysiologische mechanische stimulatie toe te passen bij het regenereren van engineered constructen. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de processen in de bioreactor moeilijk aan te leren zijn vanwege de vele stappen en alleen via een gedetailleerde demonstratie kunnen worden aangeleerd. Begin met het reinigen van secties van 30 centimeter lange siliconen slang met een binnendiameter van drie millimeter met gedestilleerd water en laat deze aan de lucht drogen.

Gebruik een schaar om voor elk stuk buisje een sectie PGA-gaas van 1,1 centimeter bij acht centimeter uit te knippen. Gebruik een hemostat om het PGA-gaas met Dexon 6.0 hechtdraad aan het buisje te bevestigen door drie chirurgische knopen te leggen, gevolgd door enkele steken met de hemostat; het vastgezette gaas vormt een PGA-steiger. Was de steigers door ze eerst één tot twee minuten in één molar natriumhydroxide te dopen, gevolgd door drie spoelingen in gedestilleerd water van twee minuten per spoeling. Dep ze tussen de wasbeurten droog en laat ze na de derde wasbeurt 15 minuten aan de lucht drogen in een zuurkast.

Zodra deze droog zijn, hecht u met drie steken Dacron-manchetten van één centimeter op elk uiteinde van het gaas. Laat een overlap van twee tot drie millimeter van de buis over en prik niet door de buis heen. Zorg ervoor dat u ongeveer 15 centimeter vrije hechtdraad overlaat voor later gebruik in dit protocol.

Alle bioreactorcomponenten en instrumenten worden vooraf geautoclaveerd. De dag voordat de bioreactorkweek wordt gestart, moet de bioreactor gedeeltelijk worden geassembleerd; dompel de bioreactorcomponenten, de scaffolds, het gaas, de siliconen slang, de chirurgische instrumenten en een dunne draad die langer is dan de lengte van de bioreactor gedurende ten minste 30 minuten onder in een bad met 70% ethanol. Gebruik de draad om de siliconen slang door de zijarmen van de reactor te trekken.

Haal nu de bioreactor naar buiten en bevestig de PGA-steigers binnenin door de Dacron-manchetten over de uitlopende glazen randen vast te zetten. Gebruik het overtollige hechtmateriaal om elke manchet vast te knopen. Sluit vervolgens, met behulp van connectoren, de siliconen slang aan één zijde van de steiger aan op één paar bioreactorarmen en sluit de slang aan de andere zijde van de steiger aan op de andere twee armen.

Wanneer de connectoren zijn geïnstalleerd, trekt u deze uit de zijarmen en spoelt u de bioreactor uit met ethanol. Laat de reactor aan elke zijde 10 minuten weken. Plaats de bioreactor op enkele Petrischalen en spoel deze uit met weefselkweekmedium.

Spoel het water af. Gebruik een pipet en zorg ervoor dat ook het gaas en de slang worden doorgespoeld. Plaats nu een steriele roerstaf in de reactor voor toekomstig gebruik en droog de apparatus gedurende de nacht in de zuurkast met de ventilator aan en de UV-lamp vanaf dit punt uitgeschakeld.

Leun niet over de reactor, omdat dit tot contaminatie kan leiden. Tijdens de installatie moeten alle connectoren met alcohol worden schoongemaakt. Voordat de koppelingen worden gemaakt, worden veel van de verbindingen versterkt met paraform, dat voor gebruik in 70% ethanol moet worden geweekt. Zorg dus voor voldoende voorraden van beide middelen.

Plaats ter preventie een steriele Petrischaal over elke opening van de bioreactor om het PGA-steunstructuur binnenin te beschermen tegen contaminanten. Begin nu met de installatie door de injectiepoort aan de derde ongebruikte arm van de bioreactor te bevestigen. Sluit vervolgens de IV-zak aan op het flowsysteem.

Knoop bij de walrus-slangenkit het blauwe uiteinde zo dicht mogelijk bij de Y-splitsing af en klem de slang. Bevestig de rode slang aan het verre uiteinde van de IV-zak. Bevestig vervolgens de witte slang aan één zijde van het flowsysteem.

Plaats een driewegkraan in het stroomsysteem. Bevestig één uiteinde van de slang van de druktransducer aan de driewegkraan en bevestig het andere uiteinde aan de middelste opening van de infuuszak. Voeg nu 350 milliliters PBS en 1% fungi zone toe aan de infuuszak om het stroomsysteem gedeeltelijk te vullen en te controleren op lekken.

Gebruik een spuit van 60 milliliter vóór of na het aansluiten van de zak op het stroomsysteem; stel de stopkraan in om de stroomrichting van de PBS te regelen en knijp in de zak om het systeem door te spoelen. Deze stap kan zowel vóór als na het plaatsen van de cellen worden uitgevoerd. De cellen kunnen nu in de bioreactor worden geplaatst.

Resuspendeer in dit voorbeeld 8 miljoen SM-cellen, wat overeenkomt met ongeveer één confluente T 75, in 1,25 milliliter medium en druppel deze gelijkmatig op het PGA-steigerwerk, van Dacron-verbinding tot Dacron-verbinding. Maak na toevoeging van de cellen de rand van de bioreactor schoon met alcohol. Vermijd het vooroverbuigen boven de reactor.

Zet vervolgens het siliconen stopdeksel zorgvuldig in elkaar. Zorg ervoor dat de onderkant van het deksel niet wordt blootgesteld bij het uitnemen uit de autoclaafzak of tijdens de volgende bevestigingsstappen. Bevestig eerst de injectiepoort aan de voedingsslang bij de mannelijke connector.

Ten tweede, bevestig PTFE 0,20 micron filters aan elk van de drie luchtopeningen. Ten derde, sluit de injectiepoort af met folie. Plaats het geassembleerde siliconen stop-deksel in de glazen bioreactor.

Zorg ervoor dat de voedingsbuis de geplaatste PGA-scaffolds niet raakt. Seal vervolgens met parafilm. Sluit nu de bioreactor aan op het flowsysteem en plaats de bioreactor en het flowsysteem in een incubator van 37 °C.

Gedurende 25 tot 30 minuten moet de reactor op zijn zijkant worden geplaatst en elke vijf minuten worden gedraaid. Vul vervolgens, terwijl de reactor nog in de incubator staat, de bioreactorkamer met 400 milliliters vier tot 10 cultuurmedium met behulp van een pomp via een toevoerslang. Incubeer de gezaaide scaffolds nu zonder pulserende pomping gedurende zes tot zeven dagen bij 37 °C met 5% koolstofdioxide.

Er is geen mediumverversing of vitamine C-suppletie nodig gedurende deze tijd. Controleer vóór het inschakelen van de pomp de slang op lekken of knikken. Stel vervolgens de snelheid van de pomp zo in dat een drukbereik tussen -30 en 270 mmHg wordt gehandhaafd. Controleer en handhaaf deze druk dagelijks gedurende de gehele kweekperiode.

Mediumverversingen en suppletie van ascorbinezuur moeten tweemaal per week worden uitgevoerd terwijl het steigerwerk groeit met pulserende pomping om eerst vers medium toe te dienen; bevestig hiervoor de injectiepoort en het PTFE-filter op de voedingsdeksels voor zowel de mediumverversing als de afvoer van afvalmedium. Plaats vervolgens de voedingsslang stevig in de bidirectionele pomp en steek het ene uiteinde in de voedingspoort van de bioreactor en het andere uiteinde in het voedingsdeksel. Begin nu langzaam met het uitpompen van 200 milliliters medium.

De pompsnelheid kan geleidelijk worden verhoogd. Bevestig vervolgens een nieuwe toevoerbuis en begin langzaam met het pompen van 200 milliliters vers medium. Om ascorbinezuur aan de reactor toe te voegen, verwijdert u 25 milliliters medium met een steriele 30 milliliters spuit.

Voeg vijf milliliter steriele ascorbinezuuroplossing toe en vul vervolgens de 25 milliliter aan. De gekweekte vaten zullen opaak lijken en een wanddikte van ongeveer 250 microns bereiken na acht weken cultuur. Onder pulserende omstandigheden laat hematoxyline, eosine-kleuring van de gekweekte vaten weefselmorfologische veranderingen zien over de tijd en door het pulseren.

De luminale zijde van de vaten is aangegeven met een L; een Masson's trichroomkleuring. Voor collageen laat dit zien dat het vier weken gepulseerde vat meer collageen heeft dan het niet-gepulseerde tegenhangertje; witte pijlen wijzen naar resterende PGA-fragmenten in de vaten na 12 weken. Immunochemische analyse toont de expressie van de vroege gladde spier marker alfa-actine, de intermediaire gladde spier marker calponine 1 en de late gladde spier marker myosin heavy chain. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in zeven tot acht uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alles zo schoon en steriel mogelijk uit te voeren volgens dit protocol. Andere methoden, zoals modificatie van het lumen van de gekweekte vaten, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het belang van luminale oppervlaktemodificatie voor het behoud van gekweekte vaten tijdens in vivo studies na hun ontwikkeling.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van tissue engineering, in het bijzonder vasculaire engineering, om potentiële methoden te onderzoeken voor de behandeling van coronaire arterieziekten in diermodellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe implanteerbare engineered vasculaire grafts kunnen worden gerealiseerd via een dynamische post-cultuur. Vergeet niet dat het werken met natriumhydroxide gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals oogbescherming en een laboratoriumjas, altijd moeten worden betracht bij het uitvoeren van deze procedure.