Elastomeer PGS Steigers in Arterial Tissue Engineering

Deze video laat zien hoe poreuze tubulaire scaffolds gefabriceerd kunnen worden en hoe deze onderworpen worden aan dynamische mechanische conditionering voor arterieel weefselkweek. Dit wordt bereikt door eerst de scaffolds te vervaardigen met behulp van een biologisch afbreekbaar elastomeer en een assault-fusiemethode. De scaffolds worden vervolgens klaargemaakt voor celzaaien en gemonteerd in een bioreactorsysteem.

In de bioreactor worden vasculaire gladdespiercellen op de scaffolds gezaaid en gekweekt. Weken later wordt het weefsel geoogst en geanalyseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie, H&E-kleuring en elastine-autofluorescentie. De resulterende gladde spierlaag is zowel meerlagig als loodrecht georiënteerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek, vergelijkbaar met partikelbleken, is het gebruik van een glazen mal voor de fabricage van een poreuze tubulaire steunstructuur en hyaluronzuur. Terwijl de mal wordt verwijderd, wordt de steunstructuur klaargemaakt vanuit een stuk glazen buis. Plaats de buis in een houder en giet de hyaluronzuuroplossing die de vorige dag is bereid in de buis.

Het hyaluronzuur stroomt langzaam langs de binnenwand naar beneden. Zodra het de bodem van de mal bereikt, wordt de mal omgedraaid. Herhaal deze stap totdat de binnenwand van de mal gelijkmatig is gecoat met de oplossing.

Droog na het coaten alle voorbereide glazen mallen in een vacuümoven bij 37 °C gedurende 24 uur. Meestal worden er vier mallen gelijktijdig voorbereid terwijl de glazen mallen drogen. Bereid de zoutdeeltjesstorten voor door de zoutdeeltjes te malen en te zeven (SVE) tot een grootte van 25 tot 32 µm.

Zet de volgende dag de voorbereide glazen mal-as, PTFE-buisjes, krimpsleeve en PTFE-ring in elkaar. Plaats eerst de as in PTFE-buisjes van 65 millimeter lengte en bak deze vijf minuten lang bij 120 graden Celsius. Om de PTFE te laten krimpen, dient een hybridisatie-incubator tijdens het wachten ten minste 30 minuten lang te worden voorverwarmd op 37 graden Celsius.

Zodra de buisjes de mandrels hebben omsloten, schuif je de krimpsleeve over de mandrel zodat deze vrij kan bewegen. Plaats vervolgens de mandrel in de glazen mal en bevestig de A-P-T-F-E ring aan de onderkant van de mandrel. Controleer of de PTFE-ring nauw aansluit op de bodem van de glazen mal.

Voeg vervolgens met een spatel en een siliconen rubberen trechter zoutdeeltjespapjes toe aan de glazen mal. Tik daarna voorzichtig met de spatel op de mal voor een gelijkmatige verdeling van de deeltjes en schraap het overtollige zout weg. Zet nu de verwarmde incubator uit en plaats er snel de gevulde mallen in; het zout zal gedurende de volgende 30 minuten samensmelten, waarna de mallen 24 uur lang gedroogd moeten worden in een vacuümoven bij 37 °C.

Verwijder de volgende dag, na het koelen, de roestvrijstalen dorn uit de mallen door deze naar buiten te duwen terwijl u de PTFE-ring vasthoudt. Gebruik indien nodig een spitongtang. Verwijder vervolgens de PTFE-ring van de onderkant van de mal.

Bak vervolgens de mallen om de huls te laten krimpen en verwijder de gekrompen hulsen uit de mallen. Laat de mallen afkoelen tot het moment van gebruik en bewaar ze in een exsiccator in een zuurkast. Gebruik een pipet om de glazen mallen onder een hoek van 45 graden te houden en laat de PGS-oplossing in het binnenste lumen vallen terwijl u de mal langzaam draait.

Controleer of de PGS-oplossing langs de wand van de mal naar beneden stroomt. Voeg meer PGS toe als er een droge plek is. Laat het THF nu gedurende ten minste 30 minuten in de zuurkast verdampen. Zodra het THF is verdampt, worden de mallen uitgehard in een vacuümoven.

Laat de mallen na één dag uitharden, koel ze af tot kamertemperatuur en dompel ze langzaam verticaal onder in gedeïoniseerd water bij 24 °C. Te snel dompelen veroorzaakt luchtbellen, waardoor de scaffold kan scheuren. Plaats de mallen voorzichtig in het waterbad.

Plaats ze onder een hoek met behulp van een siliconen buisje en laat het hyaluronzuur gedurende een uur oplossen. Als het hyaluronzuur na een uur niet uit de mal is gekomen, gebruik dan een spatel om het hyaluronzuur aan beide uiteinden langzaam uit de mal te duwen terwijl de mal nog ondergedompeld is, en schud vervolgens voorzichtig aan de mal. Controleer nu of de scaffolds niet zijn verschoven in de glazen mal; als dat wel het geval is, trek de scaffold dan langzaam met een pincet uit de mal.

Log daarna de zoutdeeltjes uit door de delicate steigers voorzichtig over te brengen naar een bad met gedeïoniseerd water onder zachte roering. Dit proces duurt ten minste drie dagen, waarbij het water dagelijks moet worden ververst. Nadat al het zout is uitgeloogd, wordt elke steiger overgebracht naar een centrifugebuis van 15 milliliter gevuld met gedeïoniseerd water en een uur lang ingevroren in een box met droogijs. Plaats de bevroren centrifugebuizen gedurende drie dagen in een lyofilisator met de doppen open.

Bewaar de scaffolds na het vriesdrogen in een droogmiddel totdat ze worden gebruikt. Begin met het knippen van de scaffolds in lengtes van 25 tot 30 millimeter. Bereid vervolgens twee siliconen rubberen stoppers voor door PTFE-buisjes door de middenopeningen van elke stopper te schuiven.

Snijd vervolgens stukken van anderhalf millimeter uit de hs ring en schuif een stuk over één uiteinde van het scaffold. Duw één PTFE-buis, die aan de stopper is bevestigd, in hetzelfde uiteinde van het scaffold met precies genoeg overlap om onder de HS-ring te vallen, zodat het scaffold stevig met de buis verbonden is. Krimp de HS-ring in een oven en laat de assemblage afkoelen tot kamertemperatuur. Vervolgens wordt een polycarbonaatbuis van 50 millimeter, die fungeert als de bioreactorkamer, over het scaffold geschoven en vastgezet aan het binnenoppervlak van de siliconenrubberen stopper.

Net als hiervoor worden een andere PTFE-buis en stop aan het andere uiteinde van het scaffold bevestigd met een hs-ring om de kamer te voltooien. De tweede stop is bevestigd aan het andere uiteinde van de polycarbonaatbuis. Vervolgens worden de buitenkant van de stoppers bevestigd aan twee platen van een aluminiumlegering.

Voer tweedraadse stangen in het zijgat van elke plaat en zet de platen vast metstelschroeven. Bevestig het steigerwerk aan de bioreactor. Meet nu de zichtbare lengte van elk steigerwerk, wat de afstand tussen twee hs-ringen is, en bereken hun inwendige oppervlakken.

Voor het zaaien van cellen. Steriliseer de kamers, elk afzonderlijk in folie gewikkeld, samen met elk onderdeel van de bioreactoreenheid in een autoclaaf. Assembleer de bioreactor na sterilisatie in een celcultuurkap.

Voorbehandel en spoel het scaffold met een reeks perfusies door gebruik te maken van een peristaltische pomp met een stroomsnelheid van 1 mm/min in het stroomcircuit. Begin met spoelen met 70% ethanol, 50% ethanol en vervolgens 25% ethanol gedurende elk een uur. Volg deze drie ethanolspoelingen met een PBS-spoeling van twee uur.

Perfuseer slutbehandeling de bioreactor gedurende 24 uur met SMC-kweekmedium, waarna deze klaar is voor het zaaien van cellen en experimenten. Zaai vervolgens de bioreactor, volgens de instructies in het bijbehorende manuscript, met 2 miljoen cellen per vierkante centimeter en vervang gedurende de volgende 21 dagen het medium in de slangsystemen en pas de pumpsnelheid aan. De druk in het construct zal geleidelijk toenemen van ongeveer 4 mmHg op de eerste dag van de kweek naar meer dan 100 mmHg na twee weken kweek; oogst na drie weken kweek de cellen en bereid ze voor op analyse zoals gespecificeerd in het bijbehorende manuscript.

Deze tubulaire PGS-steunstructuren werden vervaardigd via de salt fusion-methode. Scanning-elektronenmicrografieën toonden aan dat alle steunstructuren homogene wanddiktes hadden en dat er geen gedeeltelijke defecten in hun dwarsdoorsneden aanwezig waren. Op het luminale oppervlak van alle steunstructuren werden willekeurig verdeelde macro- en microporiën waargenomen.

Na de celkweek groeiden de meerlaagse SMC's met een oriëntatie loodrecht op de stroomrichting. Bovendien bedekten de cellen en DCM-eiwitten het lumen van alle PGS-constructen volledig. Elastine-autofluorescentie toonde daarnaast circumferentieel georganiseerde elastische vezels aan het luminale oppervlak van het construct.

Na het bekijken van deze video zou u begrijpen hoe u een poreuze tubulaire scaffold maakt, de cellen observeert en de scaffold kweekt met behulp van een vooraf ontworpen bioreactor.