Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

Dit experiment is ontworpen om lipidbindende eiwitten te identificeren en de interactie tussen lipiden en eiwitten te analyseren in een gedefinieerde membraanomgeving van lipidvesikels. Eiwitten uit celhomogenaat worden geïncubeerd met vers bereide lipidvesikels van fosfatidylserine en ceramide. Het reactiemengsel wordt vervolgens aangevuld met magnetic beads geconjugeerd aan Annexin V om de eiwitten die geassocieerd zijn met de lipidvesikels aan de magnetic beads te verankeren. Vervolgens worden de eiwit-lipidvesikels gezuiverd middels magnetisch geactiveerde cellsortering.

Om de resultaten van het gebonden lipide-eiwit te identificeren, wordt SDS-PAGE Western blotting gebruikt om de lyx-zuivering van endogene en recombinante atypische PKC en een specifiek ceramide-bindend domein tot expressie gebracht in MDCK-cellen aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze nieuwe techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ELISA of plasmonresonantiespectroscopie, zoals oppervlaktebinding, is dat de lipide-eiwitinteractie wordt bereikt in een membraanachtige omgeving en dat de bindende eiwitten kunnen worden gezuiverd en geanalyseerd. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie en diagnose van ziekten waarbij lipiden betrokken zijn, omdat de fysiologische lipide-eiwitinteractie bij deze ziekten is verstoord.

Voor sommige van deze ziekten zijn de eiwitdoelen nog niet bekend en moeten deze worden geïdentificeerd. Om een therapie op basis van lipiden te ontwerpen, begint men met lipid-SLE's die zijn bereid uit een gedroogd mengsel van equimolaire hoeveelheden fosfatidylserine en C16-ceramide in 100 µL sical-buffer. Sonicate gedurende één uur na toevoeging van 300 µL sical-buffer, aangevuld met 0,1 mM mangaanchloride. Centrifugeer de monsters bij 12.000 ×g gedurende 20 minuten bij 4 °C en resuspendeer vervolgens het pellet van grote lipid-vesikels in 100 µL sical-buffer. Voeg 1 nM van de fluorescerende kleurstof vibrant cm DII toe en incubeer bij 37 °C gedurende één uur om de visualisatie van de SLE-fractie na max-separatie te vergemakkelijken. Herstel een roze pellet van vibrant cm dai-gekleurde fosfatidylserine-ceramide-SLE's door centrifugatie en resuspendeer in 100 µL tris-buffer.

Soniceren vervolgens de cellen in 300 µL hypertoon buffer van 10 mM tris, waterstofchloride met protease- en fosfataseremmers en centrifugeren om een detergentvrij cellysaat te verkrijgen. Voeg nu het heldere cellysaat toe aan de lipid fysieke suspensie en incubeer het mengsel gedurende twee uur bij 4 °C om membraanresten te verwijderen. Aangezien cellysaten endogene membranen met fosforylerine kunnen bevatten, wordt aanbevolen om het lysaat van deze membranen te zuiveren via aanvullende centrifugatiestappen.

Vul het reactiemengsel aan met 20 µL XNV-bindingsbuffer en 50 µL van een oplossing met magnetische beads geconjugeerd aan een XNV; incubeer dit gedurende één uur bij 4 °C en voer de magnetische geactiveerde cel sortering uit zoals aanbevolen in het protocol van de fabrikant. Monitor vervolgens de vibrante CM DII-fluorescentie in de doorstroom- en elutiefracties met een microplaat-fluorescentiereader om de aanwezigheid en hoeveelheid lipiden in een antilichaam-competitieassay te bepalen. Om de specificiteit van de bindingsreactie van A PKC voor de ceramide fosfoserine-vesikels te verifiëren, wordt 1 µg anti-PKC zeta konijnen polyklonaal antilichaam gedurende één uur bij 4 °C geïncubeerd met een cellysaat, gevolgd door incubatie met de lipidvesikels.

Ga verder met SDS-PAGE en immunoblotanalyse van de eiwitbinding aan de fosfoseryneceramiden in het maximale eluaat voor de in vitro reconstitutie van een lipide-eiwit-polariteitscomplex. Begin met een pelletpreparatie van fosfoseryneceramide-vesikels die eerder met vibrant CM DII zijn gekleurd; resuspendeer de vesikels in 100 µL TRI-buffer, aangevuld met 100 µM gamma-S-GTP, 1 mM GDP en een combinatie van de relevante recombinante eiwitten. Incubeer de reactie vervolgens gedurende drie uur bij 4 °C. Voeg daarna 5 µL van een 20 x voorraadoplossing van X-in-V-buffer en 50 µL X-in-V-geconjugeerde magnetische beads toe.

Incubeer het mengsel onder zachte agitatie nog 30 minuten bij 4 °C. Ga verder met de NX NV magnetische geactiveerde cel-sortering volgens het protocol van de fabrikant om de precipitatie te faciliteren. Vul de elutiefractie aan met 10 µg puur e albumine.

Concentreer de eiwitten door weyl flue-precipitatie. De onderste fase bestaat uit chloroform-methanol met verrijkte vibrant cm dii. De bruinachtige interfase bevat de magnetische beads en het geprecipiteerde eiwit.

Kwantificeer de lipidenvesikels door detectie van roze, levendig cm dii in de organische chloroform-methanolfase van de weyl flu-reactie. Gebruik gelijke hoeveelheden lipidenvesikels om de hoeveelheden eiwit tussen monsters te normaliseren en analyseer deze via SDS-PAGE en immunoblottings.

Een detergentvrij lysaat van MDCK-cellen die full-length PKC Zetta tot expressie brengen, C-terminaal gekoppeld aan een groen fluorescent eiwit of een ceramide-bindend domein. In de C-terminus van pkc. Zetta werd geïncubeerd met fosfoserine.

Na elutie van de max-kolom werden de ceramide-vesikels en eiwitten geanalyseerd via immunoblotting. Het ceramide-bindende fragment C 20 Zeta, EGFP en full-length PKC Zeta werden teruggevonden in het eluaat van de max-kolom, wat consistent is met de specificiteit en efficiëntie van de lyx-procedure. De negatieve controle EGFP, die niet bond aan de fosfoserine-ceramide-vesikels, was niet detecteerbaar in het eluaat.

Wanneer Linx wordt gecombineerd met andere methoden zoals SDS-page en western blotting of proteomics-analyse, kunnen aanvullende vragen worden beantwoord, zoals welke eiwitten deel uitmaken van het lipidebindend eiwitcomplex. Na de ontwikkeling heeft LabX de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van enkelvoudig lipidenonderzoek om ceramide-geïnduceerde apoptose en celpolariteit in neurale stamcellen en epitheelcellen te bestuderen.